人Aβ42表達(dá)純化及其納米抗體的淘選.pdf

1、碩士學(xué)位論文人A p 4 2 表達(dá)純化及其納米抗體的淘選T h e e x p r e s s i o na n d p u r i l F i c a t i o n o fh u m a n A p 4 2 a n d b i o p a n n i n g o fn a n o b o d i e sa n t i —A p 4 2學(xué)科、 專業(yè)：學(xué) 號(hào)：指導(dǎo)教師：完成日期：生物化工2 1 2 1 8 0 9 5徐麗副教授2 0 1

2、 5 年5 月大連理工大學(xué)D a l i a n U n i V e r s i t yo f T e c h n o l o g y大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文摘 要機(jī)體內(nèi)淀粉樣p 肽4 2 ( A m y l o i d b e t ap e p t i d e4 2 ，A p 4 2 ) 的濃度和聚集狀態(tài)與阿爾茨海默癥( A l z h e i m e r ’sd i s e a s e ，A D ) 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，獲得針對(duì)不同

3、A p 4 2 的高親和力抗體是目前A D 早期診斷和治療的研究熱點(diǎn)。但該方面的研究仍存在兩個(gè)問(wèn)題( 1 )A B 4 2 分子量小、疏水性強(qiáng)，直接用傳統(tǒng)疏水作用方式包被抗原嚴(yán)重影響抗原構(gòu)象，影響抗體的篩選，定點(diǎn)固載A p 4 2 可能更有利于A p 4 2 抗體的篩選；( 2 ) 目前己報(bào)道的A p 4 2抗體中只有少數(shù)幾種能識(shí)別有限的聚集體類型，大多數(shù)抗體只能識(shí)別A D 4 2 的一級(jí)結(jié)構(gòu)，不能區(qū)分不同構(gòu)象的A B 4 2 聚集體。

4、針對(duì)上述問(wèn)題本論文進(jìn)行了兩方面研究( 1 ) 依據(jù)A B 4 2 沒(méi)有巰基的特點(diǎn)，分別表達(dá)并分離純化A p 4 2 和氮端引入一個(gè)C y s 的A p 4 2( C ．A B 4 2 ) ，為后續(xù)動(dòng)物免疫和通過(guò)定點(diǎn)固載A p 4 2 進(jìn)行抗體篩選提供材料： ( 2 ) 與普通抗體相比，納米抗體在構(gòu)象識(shí)別方面具有更大的優(yōu)勢(shì)，因此本論文在免疫羊駝并構(gòu)建納米抗體的噬菌體展示文庫(kù)后，進(jìn)行了A B 4 2 納米抗體的篩選。研究結(jié)果如下：( 1 )

5、 A B 4 2 與C ．A p 4 2 的制備。利用基因合成方法獲得了A p 4 2 及C ．A p 4 2 基因，并將基因片段插入p E T 2 3 a 表達(dá)載體，在E ．c D ，fB L 2 1 ( D E 3 ) 中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物A p 4 2 與C ．A p 4 2皆以包涵體形式存在。包涵體經(jīng)清洗與六氟異丙醇預(yù)處理后，用陰離子交換層析一步純化，得到S D S ．P A G E 分析中純度高于9 5 ％的終產(chǎn)品，產(chǎn)量可達(dá)4 0

6、 m g ／L 。洗脫產(chǎn)物經(jīng)透析、冷凍干燥制成粉末，一8 0 ℃保存?zhèn)溆谩? 2 ) A B 4 2 與C ．A B 4 2 的性質(zhì)鑒定。上述產(chǎn)品重懸于相應(yīng)溶液進(jìn)行性質(zhì)分析。電泳和質(zhì)譜檢測(cè)表明分子量與理論值相符且純度高，點(diǎn)雜交分析具有良好的免疫原性，圓二色譜表明具有富含B 折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)。同時(shí)，硫黃素T 熒光分析表明二者聚集性質(zhì)相似，且C —A B 4 2 聚集較快，震蕩可加速聚集過(guò)程。M T T 實(shí)驗(yàn)顯示產(chǎn)品對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞具有較

7、強(qiáng)毒性。以上結(jié)果表明純化所得A p 4 2 與C ．A p 4 2 具有良好的生理生化活性，可以作為抗原進(jìn)行抗體篩選。( 3 ) 定點(diǎn)固載抗原法篩選納米抗體。利用引入的巰基標(biāo)簽與9 6 孔板上已有的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)抗原固載，從經(jīng)上述產(chǎn)品免疫后的納米抗體庫(kù)中篩選抗體。比較了傳統(tǒng)包被和定點(diǎn)包被抗原的篩選效果，結(jié)果表明定點(diǎn)固載更有利于高活性抗體的富集。同時(shí)比較了定點(diǎn)包被時(shí)p H 與還原劑的影響，表明最佳固載p H 為6 ．9 5 ，且