質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

1、1,質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),色譜-質(zhì)譜聯(lián)用,2,色譜：混合物分離質(zhì)譜：純物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：GC-MS；LC-MS；,色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀,基本工作原理是：利用一種具有分離技術(shù)的儀器，作為質(zhì)譜儀的"進(jìn)樣器"，將有機(jī)混合物分離成純組分進(jìn)入質(zhì)譜儀，充分發(fā)揮質(zhì)譜儀的分析特長，為每個組分提供分子量和分子結(jié)構(gòu)信息。,3,GC-MS,氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器（ 簡稱氣質(zhì)聯(lián)用，GC-MS）是分析儀器中較早實現(xiàn)聯(lián)用技術(shù)的儀器。,4,一

2、、GC-MS聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，主要是圍繞以下三個問題的解決而不斷取得進(jìn)展的：1.氣相色譜柱出口氣體壓力和質(zhì)譜正常工作所需要的高真空的適配；2.質(zhì)譜掃描速度和色譜峰流出時間的相互適應(yīng)；3.必須能同時檢驗色譜和質(zhì)譜信號，獲得完整的色譜、質(zhì)譜圖。,5,要使氣相色譜和質(zhì)譜儀器聯(lián)用，首先要解決的問題是氣壓問題。色譜柱出口壓通常是常壓，而質(zhì)譜儀在正常工作壓力是高真空，故二者無法相接。必須采用一個連接器，用來除去載氣，以降低氣相色譜流出物的氣壓并

3、富集試樣，以達(dá)到質(zhì)譜儀的工作要求。,6,GC-MS聯(lián)用儀的接口是解決氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的關(guān)鍵組件。接口作用：（1）   壓力匹配——質(zhì)譜離子源的真空度在10-4Pa，而GC色譜柱出口壓力高達(dá)105Pa，接口的作用就是要使兩者壓力匹配。（2）  組分濃縮——從GC色譜柱流出的氣體中有大量載氣，接口的作用是排除載氣，使被測物濃縮后進(jìn)入離子源。,7,常見接口技術(shù)有：a    

4、 直接連接法（主要用于毛細(xì)管柱）在色譜柱和離子源之間用長約50cm，內(nèi)徑0.5mm的不銹鋼毛細(xì)管連接，色譜流出物經(jīng)過毛細(xì)管全部進(jìn)入離子源，這種接口技術(shù)樣品利用率高。b     開口分流連接 該接口是放空一部分色譜流出物，讓另一部分進(jìn)入質(zhì)譜儀，通過不斷流入清洗氦氣，將多余流出物帶走。此法樣品利用率低。,8,9,2、掃描速度沒與色譜儀聯(lián)接的質(zhì)譜計一般對掃描速度要求不高。和氣相色譜儀聯(lián)

5、接的質(zhì)譜計，由于氣相色譜峰很窄，有的僅幾秒鐘時間。一個完整的色譜峰通常需要至少 6個以上數(shù)據(jù)點。這樣就要求質(zhì)譜儀有較高的掃描速度，才能在很短的時間內(nèi)完成多次全范圍的質(zhì)量掃描。另一方面，要求質(zhì)譜計能很快地在不同的質(zhì)量數(shù)之間來回切換，以滿足選擇離子檢測的需要。,10,,3、GC-MS檢測器必須能同時檢驗色譜和質(zhì)譜信號，獲得完整的色譜、質(zhì)譜圖。,11,,二、GC-MS的掃描方式：質(zhì)譜儀掃描方式有兩種：全掃描和選擇離子掃描。,12,全掃描是對指

6、定質(zhì)量范圍內(nèi)的離子全部掃描并記錄，得到的是正常的質(zhì)譜圖，這種質(zhì)譜圖可以提供未知物的分子量和結(jié)構(gòu)信息?？梢赃M(jìn)行庫檢索（定性）。在全掃描模式中，質(zhì)譜圖是在色譜運行期間連續(xù)獲得的。通常，以掃描模式操作的GC-MS可產(chǎn)生三維數(shù)據(jù)陣列，記錄的強(qiáng)度既是時間（含有色譜信息）又是質(zhì)量（質(zhì)譜信息）的函數(shù)。具有不同信息含量的不同類型數(shù)據(jù)就可從這個三 維數(shù)據(jù)陣列中獲取。,13,,另外一種掃描方式叫選擇離子監(jiān)測(select ion Monirin

7、g SIM)。這種掃描方式只對選定的離子進(jìn)行檢測，而其它離子不被記錄。它的最大優(yōu)點一是對離子進(jìn)行選擇性檢測，只記錄特征的、感興趣的離子，不相關(guān)的，干擾離子統(tǒng)統(tǒng)被排除，二是選定離子的檢測靈敏度大大提高。,14,,由于選擇離子掃描只能檢測有限的幾個離子，不能得到完整的質(zhì)譜圖，因此不能用來進(jìn)行未知物定性分析。但是如果選定的離子有很好的特征性，也可以用來表示某種化合物的存在。選擇離子掃描方式最主要的用途是定量分析，由于它的選擇性好，可以把由全掃

8、描方式得到的非常復(fù)雜的總離子色譜圖變得十分簡單，消除其它組分造成的干擾。,15,三、GC-MS分析得到的主要信息：樣品的總離子色譜圖；樣品中每一個組分的質(zhì)譜圖；每個質(zhì)譜圖的檢索結(jié)果。此外，還可以得到質(zhì)量色譜圖、三維色譜質(zhì)譜圖等。對于高分辨率質(zhì)譜計，還可以得到化合物的精確分子量和分子式。,16,總離子色譜圖的橫坐標(biāo)是出峰時間，縱坐標(biāo)是峰高。圖中每個峰表示樣品的一個組份，由每個峰可以得到相應(yīng)化合物的質(zhì)譜圖。峰面積和該組份含量成正

9、比，可用于定量。,總離子色譜圖 （TIC）,17,質(zhì)譜圖： 由總離子色譜圖可以得到任何一個組分的質(zhì)譜圖。得到質(zhì)譜圖后可以通過計算機(jī)檢索對未知化合物進(jìn)行定性。檢索結(jié)果可以給出幾個可能的化合物。并以匹配度大小順序排列出這些化合物的名稱、分子式、分子量和結(jié)構(gòu)式等。使用者可以根據(jù)檢索結(jié)果和其它的信息，對未知物進(jìn)行定性分析。應(yīng)用最為廣泛的有NIST庫和Wiley庫，前者目前有標(biāo)準(zhǔn)化合物譜圖13萬張，后者有近30萬張。此外還有毒品庫，農(nóng)藥庫等專用譜

10、庫。,18,總離子色譜圖是將每個質(zhì)譜的所有離子加合得到的。同樣，由質(zhì)譜中任何一個質(zhì)量的離子也可以得到色譜圖，即質(zhì)量色譜圖。質(zhì)量色譜圖是由全掃描質(zhì)譜中提取一種質(zhì)量的離子得到的色譜圖，因此，又稱為提取離子色譜圖。,利用這一特點可以識別具有某種特征的化合物，也可以通過選擇不同質(zhì)量的離子做質(zhì)量色譜圖，使正常色譜不能分開的兩個峰實現(xiàn)分離，以便進(jìn)行定量分析。,20,GC-MS操作條件的優(yōu)化,在GC-MS分析中，色譜的分離和質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集時同時進(jìn)行的

11、。為了使每個組分都得到有效的分離和鑒定，必須選擇合適的色譜和質(zhì)譜分析條件。,21,色譜分析條件：,色譜柱類型：填充柱或毛細(xì)管柱,22,22,固定液的選擇總原則：“ 相似相溶 ”(1) 分離非極性組分時 通常選用非極性固定相。各組分按沸點順序出峰,低沸點組分先出峰。(2) 分離極性組分時 一般選用極性固定液。各組分按極性大小順序流出色譜柱，極性小的先出峰。,固定液種類,23,23,(3) 分離非極性和極性的混合物

12、 一般選用極性固定液。此時，非極性組分先出峰，極性的（或易被極化的）組分后出峰。,(4) 分離醇、胺、水等強(qiáng)極性和能形成氫鍵的化合物 通常選擇極性或氫鍵性的固定液。(5) 組成復(fù)雜、較難分離的試樣 通常使用特殊固定液，或混合固定相。,載氣流量,由圖可見存在最佳流速（uopt）。,25,,氣化溫度分流比等,26,質(zhì)譜條件：,電離電壓電子電流掃描速率質(zhì)量范圍,27,GC-MS與GC相比，主要具有以下優(yōu)點：（1）其定性

13、參數(shù)增加，定性可靠；（2）它是一種高靈敏度的通用型檢測器；（3）可同時對多種化合物進(jìn)行測量而不受基質(zhì)干擾；（4）定量精度較高。,28,在GC-MS分析中，常用的離子源有EI，CI，EI±CI復(fù)合源，場致電離源（FI），大氣壓化學(xué)電離源（APCI）等。,29,30,GC-MS的應(yīng)用,氣/質(zhì)聯(lián)用是解決復(fù)雜樣品全組分定性定量分析的有力工具。在分析檢測和研究的領(lǐng)域中起著越來越重要的作用，特別是在有機(jī)化合物常規(guī)檢測工作中幾乎成為一

14、種必備的手段。,31,,氣質(zhì)聯(lián)用儀應(yīng)用范圍： 1、凡是需要氣相色譜儀進(jìn)行檢測的場合，特別是對未知樣品進(jìn)行定性分析的地方 2、應(yīng)對各種突發(fā)事件，如有害物質(zhì)泄漏、重大環(huán)境災(zāi)害等 3、反恐斗爭、禁毒緝毒、爆炸物品分析等,32,,石化、化工、食品、環(huán)保、藥物研究、生產(chǎn)、質(zhì)控以及進(jìn)出口許多領(lǐng)域的眾多環(huán)節(jié)中都要用到GC/MS；法庭醫(yī)學(xué)中各類案件的現(xiàn)場采集物分析（嘔吐液、血液等）、毒藥、毒品檢驗與鑒定；甚至體育競技

15、運動中，國際公認(rèn)用GC/MS對運動員進(jìn)行興奮劑檢測數(shù)據(jù)可靠。,33,,世界反興奮劑組織（WADA）提出六大類禁用的藥物：興奮藥物，麻醉劑，合成代謝/類固醇，利尿劑，肽類激素和相關(guān)的化合物，以及其它的禁用藥物。這些類別包括400種化合物和上千種相關(guān)的化合物。,34,,興奮劑類藥物目的：在比賽中，可以提高機(jī)敏和沖擊能力而減輕疲勞。用途：長跑，單車，美式足球，棒球分析儀器：氣質(zhì)聯(lián)用儀化合物舉例：安非他明，咖啡因，可卡因和麻黃堿,35,

16、,麻醉藥目的：在訓(xùn)練和比賽中減少痛感。用途：拳擊，接觸性運動項目，及其它訓(xùn)練中快速恢復(fù)的項目分析儀器：氣質(zhì)聯(lián)用儀化合物舉例：海洛因，嗎啡，美沙酮和鴉片,36,合成代謝/類固醇 目的：在訓(xùn)練中增加肌肉的強(qiáng)度和塊頭用途：所有的項目，包括舉重，體操，田徑分析儀器：氣相，液相，質(zhì)譜化合物舉例：睪丸激素，19-去甲睪酮，THG,β-激動劑 利尿劑     &

17、#160;           目的：降體重，通過排小便逃避興奮劑檢查用途：與體重有關(guān)的項目，如舉重，摔跤和拳擊；也可能用于所有運動用于逃避興奮劑檢查分析儀器：氣相色譜，液相色譜，質(zhì)譜化合物舉例：甘露醇，Dexa-trim,37,肽類激素和有關(guān)的化合物目的：增加肌肉強(qiáng)度和塊頭，增加承受力用途：各種運動項目；例如，生長

18、激素和因子被用于高強(qiáng)度運動和強(qiáng)壯身體，促紅細(xì)胞增長素（EPO）用于增加耐力，如自行車和長跑項目分析儀器：液相色譜，質(zhì)譜和酶聯(lián)免疫；藥物濫用準(zhǔn)確確認(rèn)比較困難，因為人體自然就有此類化合物化合物舉例：人生長激素（HGH）和促紅細(xì)跑生長素（EPO） 其它禁用藥物      目的：許多藥物，盡管還沒有被認(rèn)為可以加強(qiáng)體能用途：多種運動項目；例如，β-阻斷劑被用于需要高

19、注意力的項目（射擊，射箭項目），可以平靜心情和減少收顫。分析儀器：氣相色譜，液相色譜，質(zhì)譜化合物舉例：皮質(zhì)激素，β-阻斷劑， 酒精，局部麻醉藥，大麻,38,,樣品分析流程和檢測手段大多數(shù)藥物檢測實驗室的三種主要技術(shù)是，氣相色譜，液相色譜和質(zhì)譜。這些具有極高的靈敏度的檢測技術(shù)確保每一個藥物使用者都無法逃脫。例如，它們能夠檢測出比賽前十個月服用的合成類固醇激素藥物。,39,,安捷倫科技大量的儀器設(shè)備被用于2004年雅典奧運會的藥品檢測

20、；不僅大量使用三種傳統(tǒng)儀器設(shè)備---氣相色譜(GC),液相色譜（HPLC）和氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS）, 當(dāng)時最新的液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC/MS）也成為興奮劑檢測的有利武器.,40,,安捷倫科技在2008年北京奧運會的藥品檢測工作中的作用會與以往歷屆奧運會相同，為中國反興奮劑中心提供最先進(jìn)的儀器設(shè)備,優(yōu)質(zhì)的售后服務(wù)和技術(shù)支持.,41,在藥物的生產(chǎn)、質(zhì)量控制和研究中有廣泛的應(yīng)用，特別在中藥揮發(fā)性成分的鑒定、食品和中藥中農(nóng)藥殘留

21、量的測定。,42,醫(yī)藥十幾種先天性代謝疾病，也叫先天性代謝缺陷（Inborn error of metabolism ，IEM）現(xiàn)在都可以通過新生兒篩檢試驗測到，特別是使用氣相色譜－質(zhì)譜法進(jìn)行監(jiān)測。GC-MS可以測定尿中的化合物，甚至該化合物在非常小的濃度下都可被測出。這些化合物在正常人體內(nèi)不存在，但出現(xiàn)在患代謝疾病的人群中。因而，該方法日益成為早期診斷IEM的常用方法，這樣及早指定治療方案最終導(dǎo)致更好的預(yù)后。目前能用GC-MS在出生時

22、，通過尿液監(jiān)測測出100種以上遺傳性代謝異常。,43,食品、飲料和香水分析食品和飲料中包含大量芳香化合物。一些是天然就存在于原材料中另外一些是在加工時形成的。GC-MS廣泛地用于分析這些化合物，它們包括：酯、脂肪酸、醇、醛、萜類等。GC-MS也用于測定由于腐壞和摻假所造成的污染物，這些污染物可能是有害的，而且，常常由政府有關(guān)部門對其實行控制。例如，殺蟲劑。,44,,社會安全9．11后開發(fā)的爆炸物監(jiān)測系統(tǒng)已經(jīng)成為全美國飛機(jī)場設(shè)施的一部分。

23、這些監(jiān)測系統(tǒng)的操作依賴大量的技術(shù)，其中，許多是基于GC-MS的。,45,What is it?,46,在食品制作需要檢查蛋白質(zhì)含量，但是直接測量蛋白質(zhì)含量技術(shù)上比較復(fù)雜，成本也比較高，不適合大范圍推廣，所以業(yè)界常常使用一種叫做“凱氏定氮法”的方法，通過食品中氮原子的含量來間接推算蛋白質(zhì)的含量。也就是說，食品中氮原子含量越高，這蛋白質(zhì)含量就越高。因此，三聚氰胺被派上大用場了。,47,,蛋白質(zhì)主要由氨基酸組成，其含氮量一般不超過30%，而三

24、聚氰胺的分子式含氮量為66％左右。通用的蛋白質(zhì)測試方法“凱氏定氮法”是通過測出含氮量來估算蛋白質(zhì)含量，因此，添加三聚氰胺會使得食品的蛋白質(zhì)測試含量偏高，從而使劣質(zhì)食品通過食品檢驗機(jī)構(gòu)的測試。有人估算在植物蛋白粉和飼料中使測試蛋白質(zhì)含量增加一個百分點，用三聚氰胺的花費只有真實蛋白原料的1/5。三聚氰胺作為一種白色結(jié)晶粉末，沒有什么氣味和味道，摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)。,48,,2008年9月，中國爆發(fā)三鹿嬰幼兒奶粉受污染事件，導(dǎo)致食用了受污染奶粉

25、的嬰幼兒產(chǎn)生腎結(jié)石病癥，其原因是奶粉中含有三聚氰胺。三聚氰胺不是食品原料，也不是食品添加劑，禁止人為添加到食品中。對在食品中人為添加三聚氰胺的，依法追究法律責(zé)任。三聚氰胺作為化工原料，可用于塑料、涂料、粘合劑、食品包裝材料的生產(chǎn)。資料表明，三聚氰胺可能從環(huán)境、食品包裝材料等途徑進(jìn)入到食品中，其含量很低。據(jù)醫(yī)學(xué)專家介紹，三聚氰胺是一種低毒性化工產(chǎn)品，嬰幼兒大量攝入會引起泌尿系統(tǒng)疾患。,49,圖中，橫坐標(biāo)表示離子的質(zhì)荷比（m/z）值，從

26、左到右質(zhì)荷比的值增大，對于帶有單電荷的離子，橫坐標(biāo)表示的數(shù)值即為離子的質(zhì)量；,50,,超高效液相色譜法：在奶粉樣品中加入三氯乙酸和醋酸鉛溶液使蛋白質(zhì)部分沉淀，過混合型陽離子交換柱(MCX) 純化, 離心后用0. 45μm 濾膜過濾, 用超高效液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC2MS2MS) 分析測定。 優(yōu)缺點：該法測定低含量三聚氰胺成份靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確，但儀器昂貴。

27、,51,,氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用法：樣品經(jīng)三氯乙酸使蛋白沉淀離心后過MCX固相萃取柱凈化,氮氣吹干、硅烷化衍生,再由氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測。 優(yōu)缺點：試劑用量少，精確度高，安全可行，但必須經(jīng)過復(fù)雜的衍生步驟，操作繁瑣，工作效率低。,52,儀器結(jié)構(gòu),色譜-四極桿質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)示意圖,53,,注意：進(jìn)行GC-MS分析的樣品應(yīng)是有機(jī)溶液，水溶液中的有機(jī)物一般不能測定，須進(jìn)行萃取分離變?yōu)橛袡C(jī)溶液，或采用頂空進(jìn)樣技術(shù)

28、。有些化合物極性太強(qiáng)，在加熱過程中易分解，例如有機(jī)酸類化合物，此時可以進(jìn)行酯化處理，將酸變?yōu)轷ピ龠M(jìn)行GC-MS分析，由分析結(jié)果可以推測酸的結(jié)構(gòu)。如果樣品不能汽化也不能酯化，那就只能進(jìn)行LC-MS分析了。,54,,據(jù)統(tǒng)計，已知化合物中約80%的化合物是親水性強(qiáng)、揮發(fā)性低的有機(jī)物，熱不穩(wěn)定化合物及生物大分子，這些化合物的分析不適宜用氣相色譜分析，只能依靠液相色譜。,55,簡介 1977年，LC/MS開始投放市場1978年，LC/MS首次

29、用于生物樣品分析1984年 第一臺電噴霧MS儀宣告誕生1988年 電噴霧離子源MS 首次應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分析,二、液質(zhì)聯(lián)用儀LC-MS,56,2002年美國質(zhì)譜協(xié)會統(tǒng)計的藥物色譜分析各種不同方法所占的比例。1990年，HPLC高達(dá)85%，而2000年下降到15%，相反，LC/MS所占的份額從3%提高到大約80%。,57,LC-MS要解決的重要問題,由于LC的一些特點，在實現(xiàn)聯(lián)用時所遇到的困難比GC-MS大得多。,液相色譜流動相流速一般

30、為1mL?min -1，如果流動相為甲醇，其氣化后換成常壓下的氣體流速為560 mL? min -1 ，這比氣相色譜流動相的流速大幾十倍。因此，在進(jìn)入質(zhì)譜計前必須要先清除流動相對質(zhì)譜儀的影響。,58,質(zhì)譜離子源溫度對液相色譜分析源的影響液相色譜的分析對象主要是難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定物質(zhì)，這與質(zhì)譜儀中常用的離子源要求樣品汽化是不相適應(yīng)的，這使得由液相轉(zhuǎn)化為氣相的任務(wù)更具有挑戰(zhàn)性，尤其是要保證組分的完整性。,59,,液質(zhì)聯(lián)用的接口必須要解決三個

31、主要的問題,1.去除溶劑 2.保留樣品3.電離化合物,60,液-質(zhì)聯(lián)用接口技術(shù)主要是沿著三個分支發(fā)展的：,（1）流動相進(jìn)入質(zhì)譜直接離子化，形成了連續(xù)流動快原子轟擊技術(shù)等；（2）流動相霧化后除去溶劑，分析物蒸發(fā)后再離子化，形成了“傳送帶式”接口和離子束接口等；（3）流動相霧化后形成的小液滴解溶劑化，氣相離子化或者離子蒸發(fā)后再離子化，形成了熱噴霧接口、大氣壓化學(xué)離子化和電噴霧離子化技術(shù)等。,61,目前，LC-MS最常用的二種連

32、接方式是電噴霧離子化（ESI）法、大氣壓化學(xué)電離（APCI）法。,LC-MS的連接方式,62,大氣壓化學(xué)離子源(APCI),電噴霧離子源(ESI),63,ESI工作原理,電噴霧電離是在液滴變成蒸汽，產(chǎn)生離子發(fā)射的過程中形成的，溶劑由液相泵輸送到ESI探針，經(jīng)其內(nèi)的不銹鋼毛細(xì)管流出，這時給毛細(xì)管加2-4 KV的高壓，由于高壓和霧化氣的作用，流動相從毛細(xì)管頂端流出時，會形成扇狀噴霧，使液滴生成含有樣品和溶劑離子的氣溶膠。,64,,ESI 源

33、主要由五部分組成：（1）流動相導(dǎo)入裝置；（2）真正的大氣壓離子化區(qū)域，通過大氣壓離子化產(chǎn)生離子；（3）離子取樣孔；（4）大氣壓到真空的界面；（5）離子光學(xué)系統(tǒng)，該區(qū)域的離子隨后進(jìn)入質(zhì)量分析器。,65,66,ESI將離子從液相轉(zhuǎn)化到氣相的基本過程如下：,67,1. 在噴霧毛細(xì)管尖端產(chǎn)生帶電霧滴;　　2. 通過溶劑蒸發(fā)和霧滴分裂使帶電霧滴變小，反復(fù)進(jìn)行直到很小的帶電霧滴?！　?. 由很小的帶電霧滴產(chǎn)生氣相離子。,68,ESI適用于容易

34、在溶液中形成離子的樣品或極性化合物。因具有多電荷能力，所以其分析的分子量范圍很大，既可用于小分子分析，又可用于多肽、蛋白質(zhì)和寡聚核苷酸分析。,69,優(yōu)點：具有高的離子化效率，對蛋白質(zhì)而言接近100%；離子化模式多，正負(fù)離子模式均可以分析 ；穩(wěn)定的多電荷離子的產(chǎn)生，使分子量測定范圍可高達(dá)幾十萬甚至上百萬；“ 軟”離子化方式使熱不穩(wěn)定化合物得以分析并產(chǎn)生高豐度的準(zhǔn)分子離子峰；通過調(diào)節(jié)離子源電壓，可以控制離子的斷裂，給出結(jié)構(gòu)信息。,

35、70,,缺點：流速受限 0.2 mL 最大流速1 mL/min,71,APCI是在大氣壓下利用電暈放電來使氣相樣品和流動相電離的一種離子化技術(shù)，要求樣品有一定的揮發(fā)性，適用于非極性或低、中等極性的化合物。由于極少形成多電荷離子，分析的分子量范圍受到質(zhì)量分析器質(zhì)量范圍的限制。,72,在APCI中，樣品溶液是借助于霧化器的作用，噴入高溫（500度）的蒸發(fā)器，此時，溶劑和溶質(zhì)均成為蒸汽。氣化的樣品分子經(jīng)化學(xué)離子化生成氣相離子。,73,APC

36、I優(yōu)點∶,1.利用所得到[M+1]+及[M-1]–進(jìn)行分子量確認(rèn) 2.源參數(shù)調(diào)整簡單，容易使用 3.耐受性好，噴霧器及針的位置不關(guān)鍵 4.LC流速可達(dá)2.0 mL/min 5.好的靈敏度,74,,缺點： 1.有限的結(jié)構(gòu)信息 2.易發(fā)生熱裂解 3.低質(zhì)量時化學(xué)噪聲大 4.不適合做分子量大于1000的化合物,75,ESI和APCI比較,共同點：&

37、#160; 1、使用高電壓元件和霧化氣噴霧法產(chǎn)生離子 2、通常產(chǎn)生(M+H)+或(M-H)-等準(zhǔn)分子離子 3、產(chǎn)生極少的碎片，但可以控制產(chǎn)生結(jié)構(gòu)碎片 ４、非常靈敏的電離技術(shù),76,不同點：  1、生成離子的方式不同，ESI：液相離子化；APCI：氣相離子化  2、樣品兼容性 ESI：極性化合物和生物大分子； APCI：非極

38、性，小分子化合物（相對ESI而言）且有一定揮發(fā)性  3、流速兼容性 ESI：0.001到1ml/min； APCI：0.2到2ml/min  4、ESI的適用范圍要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于APCI,77,LC-MS (四極桿)聯(lián)用儀器結(jié)構(gòu)示意圖,,78,大氣壓光離子化源 (APPI),新的大氣壓離子化技術(shù)使用紫外光代替corona電暈放電方法進(jìn)行氣態(tài)化合物離子化采用高輸出通量的氣體放

39、電管輸出紫外光,,,Capillary,,HPLC inlet,Nebulizer,,Vaporizer (heater),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Drying gas,,,,UV Lamp,,79,多環(huán)芳烴的液質(zhì)分析結(jié)果,80,ESI與APCI 離子源的選擇,ESI適合范圍廣:分析離子型/極性化合物、難揮發(fā)或熱不穩(wěn)定性化合物易

40、形成多電荷離子，可以分析高分子量化合物 靈敏度高離子化受溶劑、流速的影響,APCI有一定揮發(fā)性的中等極性或低極性的小分子化合物對溶劑選擇、流速和添加物的依賴性較小,81,不同離子源可能都有響應(yīng)，但響應(yīng)值不同,82,ESI和APCI是互補(bǔ)的。熱不穩(wěn)定的或難于氣化的極性化合物適合于ESI分析。在ESI中，如樣品具有酸、堿性，則樣品分子在溶液中可去質(zhì)子生成陰離子或者接受質(zhì)子成為陽離子，或者與Na+形成加合離子。APCI適合于小分子極性

41、較低的化合物，如醇和醚類。,83,,APCI不涉及溶液化學(xué)，操作容易。此外，正相色譜通常易于與APCI連接。非極性溶劑和溶液易于蒸發(fā)，烷烴溶劑生成的試劑離子是強(qiáng)氣相酸，易于將質(zhì)子轉(zhuǎn)移至樣品分子。,84,85,,SSI 音噴離子化接口技術(shù)是于1994 年發(fā)展起來的新型接口技術(shù) , 它可適用于毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用及液質(zhì)聯(lián)用的分析, 目前主要用于分析殺蟲藥和蛋白質(zhì) 。,86,,在進(jìn)行LC-MS分析時，樣品可以利用旋轉(zhuǎn)六通閥通過LC進(jìn)樣，也可以利

42、用注射泵直接進(jìn)樣，樣品在電噴霧源或大氣壓化學(xué)電離源中被電離，經(jīng)質(zhì)譜掃描，由計算機(jī)可以采集到總離子色譜和質(zhì)譜。,87,LC-MS分析條件的選擇,88,2.正負(fù)離子模式的選擇,正離子模式適合于堿性樣品，可用乙酸（pH＝3-4）或甲酸（pH＝2-3）對樣品加以酸化。負(fù)離子模式適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣品進(jìn)行堿化。有些酸堿性并不明確的化合物，可優(yōu)先選用APCI（+）進(jìn)行測定。,89,在LC和MS聯(lián)用的情況下，由于要考慮噴霧霧化和電

43、離，因此，有些溶劑不適合于作流動相。在LC-MS分析中常用的溶劑和緩沖液有水，甲醇、甲酸、乙酸、氫氧化銨和乙酸銨等。對于選定的溶劑體系，通過調(diào)整溶劑比例和流量以實現(xiàn)好的分離。,3.流動相的選擇,90,常用的溶劑和緩沖液a 水、乙腈及甲醇 LC-MS理想的溶劑b 乙酸和甲酸 可降低LC流動相的pH值以提高分離度c 氫氧化銨/氨溶液 可提高LC流動相的pH值d 乙酸銨 是一種揮發(fā)性鹽，用于緩沖流動相，并改善色譜分離而不影響MS

44、的性能。最大濃度不超過0.1mol/L。,91,不適合的溶劑和緩沖液a 不揮發(fā)的鹽，在離子源內(nèi)析出結(jié)晶，b 表面活性劑/洗滌劑，會抑制其它化合物電離c 無機(jī)酸,92,與GC-MS類似，LC-MS也可以通過采集質(zhì)譜得到總離子色譜圖,93,94,苯二氮卓類（Benzodiazepines ）的分析,三唑(Triazolam),安定(Diazepam),12.5 ng/component,,,95,96,97,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)

45、用,LC-MS技術(shù)已經(jīng)在藥物、化工、臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)等許多領(lǐng)域中獲得廣泛的應(yīng)用。大量有機(jī)合成中間體、藥物代謝物、基因工程產(chǎn)品等的分析結(jié)果，為生產(chǎn)和科研提供了許多有價值的數(shù)據(jù)，解決了許多在此之前難以解決的問題。,98,Agilent 1100 LC/MS TRAP應(yīng)用范圍,在蛋白質(zhì)及多肽分析中的應(yīng)用在天然產(chǎn)物分析中的應(yīng)用在農(nóng)藥合成及農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用在染料(如偶氮染料)分析中的應(yīng)用;表面活性劑分析中的應(yīng)用;在高分子添加劑分析

46、中應(yīng)用在雙酚A,壬基酚及表面活性劑分析中的應(yīng)用在食品中獸藥殘留和毒素分析中的應(yīng)用在食品及飲用水中農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用天然產(chǎn)物分析或中草藥的品質(zhì)控制化妝品中違禁激素的測定保健食品中違禁藥物的檢測,99,藥物代謝研究,藥物代謝與藥物動力學(xué)研究技術(shù)上的最新重大進(jìn)展是LC-MS-MS的使用，電噴霧（ESI）和大氣壓化學(xué)電離（APCI）以及大氣壓光電離（APPI）是其主要的離子源，由于具有高靈敏度（ng/ml~pg/ml），高選擇性（

47、檢測特定的碎片離子）、高效率（每天可檢測幾百個生物樣品和對藥物結(jié)構(gòu)的廣泛適用性，對液態(tài)樣品和混合樣品的分離能力高，可通過二級離子碎片尋找原型藥物并推導(dǎo)其結(jié)構(gòu)，LC-ESI-MS-MS已廣泛地應(yīng)用于藥物代謝研究中一期生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)和二期結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定、復(fù)雜生物樣品的自動化分析以及代謝物結(jié)構(gòu)闡述等，已在世界上大型制藥企業(yè)中取代HPLC而占據(jù)了主導(dǎo)地位，其測試的樣品量占總量的70%以上。,100,天然產(chǎn)物天然藥物的研究,目前中藥開發(fā)研究有兩

48、條途徑。一條途徑是從單一植物中提取一種有效成分(單體化合物)或提取物開發(fā)成新藥。另一途徑則是中藥復(fù)方制劑的開發(fā)研究。 采用現(xiàn)代多種儀器聯(lián)用新技術(shù)，特別是高效液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)，可對其十幾種乃至幾十種化學(xué)成分進(jìn)行指紋圖譜分離鑒定。再從指紋圖譜中選擇四、五種指標(biāo)成分(有效成分或特征成分)進(jìn)行定量，可以確定出簡化的指紋圖譜和指標(biāo)成分，又是最合理的中藥復(fù)方質(zhì)量控制的方法，是研究中藥復(fù)雜體系，尤其是復(fù)方的

49、有力工具。國內(nèi)外很多學(xué)者已進(jìn)行了復(fù)方丹參、清開靈、瀉心湯、人參或黨參制劑等中藥中的主要成分的分析。,101,臨床診斷和疾病生物標(biāo)志物的分析,歐美等目前已廣泛采用HPLC/MS/MS法用于臨床診斷以及疾病生物標(biāo)志物的研究、檢測，具有專一性好、靈敏度高、成本低、分析快速，經(jīng)濟(jì)效益可觀等特點。目前可進(jìn)行新生兒遺傳疾病篩選（PKU、MCAD等四十種左右）、新生兒性激素變異的檢測、男女激素的監(jiān)測、老年癡呆癥的早期診斷、抗排異藥物的檢測、磷酸脂的檢

50、測、血紅蛋白變異檢測、糖化血紅蛋白（糖尿病早期檢測）、某些心臟病、癌癥疾病篩查如乳腺癌等等（Biomarker法、通過鑒定DNA損傷程度測定）、藥物劑量監(jiān)測、藥物相互作用監(jiān)測、地區(qū)性突發(fā)性中毒病人的毒物檢測等。,102,殘留、法醫(yī)學(xué)和環(huán)境樣品測定,專家指出，中國入世后，食品工業(yè)最大的問題就是"安全壁壘"，這將給中國的進(jìn)出口和國內(nèi)企業(yè)帶來極大的威脅。美國食品與藥品管理局 (FDA)、歐盟、日本、韓國等主要貿(mào)易國和地區(qū)公

51、布了在進(jìn)口動物源性食品中禁止使用的藥物名單，提高了最高限量標(biāo)準(zhǔn)。這就要求中國加強(qiáng)農(nóng)、畜、水產(chǎn)品中的農(nóng)藥、獸藥等殘留的控制和檢測。 同樣隨著人類對生存環(huán)境的倍加關(guān)注，要求對環(huán)境中各種污染物、有害或有毒物以及法庭科學(xué)中毒物、濫用藥物等進(jìn)行更加嚴(yán)格的監(jiān)控。而配以ESI、APCI和APPI離子化技術(shù)的LC/MS/MS以分析速度快、靈敏度高、特異性好等特點廣泛應(yīng)用與殘留和毒物分析。目前已成功地進(jìn)行數(shù)百種農(nóng)藥、獸藥、抗生素、興奮劑類殘留

52、和毒物、毒素如氯霉素、磺胺類、硝基呋喃類、毒品、多環(huán)芳烴等等化合物的檢測。,103,電噴霧正離子模式, 全掃描,法莫替丁(Famotidine)中的雜質(zhì)分析,,104,,舒喘寧（Salbutamol )降解產(chǎn)物分析,在藥物降解中,降解產(chǎn)物可能保留了紫外發(fā)光基團(tuán),其紫外光譜圖類似,所以無法通過紫外來對降解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,而利用質(zhì)譜則通過質(zhì)譜圖可以鑒定降解產(chǎn)物,UV Signal and spectra,MS TIC and EICs,105

53、,磺胺藥物分析,,sulfamethizoleMW 270,sulfadimethoxineMW 310,sulfachloropyridazineMW 284,sulfamethazineMW 278,,,共流出峰的鑒定,106,甲基橙染料降解產(chǎn)物的分析,107,Ｍass spectra of methyl orange degradation products,108,Fragmentation scheme of meth

54、yl orange degradation products.,109,液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別:,GC-MS是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用EI得到的譜圖，可與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比。 LC-MS主要可解決如下幾方面的問題：不揮發(fā)性化合物分析測定；極性化合物的分析測定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定；沒有商品化的譜庫可對比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖