串聯(lián)親和純化技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜鑒定RSK4及其變異體的相互作用蛋白.pdf

1、背景:p90核糖體S6蛋白激酶4(Ribosomal S6 protein kinase4，RSK4)是一新發(fā)現(xiàn)的抑制乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要因子，它能抑制乳腺癌細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)其衰老;而RSK4前體mRNA在可變剪切作用下形成可變剪接的變異體(RSK4m)，并具有不同的生物學(xué)功能。迄今為止，RSK4及其變異體RSK4m在乳腺癌中作用機(jī)制所知甚少。蛋白質(zhì)是生命活動的主要物質(zhì)，蛋白質(zhì)功能的實現(xiàn)，離不開與其它蛋白質(zhì)之間的相互作用?？勺兗艚邮钦{(diào)節(jié)

2、基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性的重要機(jī)制。前期研究我們認(rèn)為RSK4及其變異體與其它蛋白通過相互作用形成不同的蛋白質(zhì)復(fù)合物后在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。
　　目的：本研究擬建立哺乳動物體系中的串聯(lián)親和純化技術(shù)，并聯(lián)合質(zhì)譜分析鑒定RSK4及其變異體相互作用蛋白質(zhì)，經(jīng)生物信息學(xué)方法分析找尋RSK4及其變異體相互作用蛋白中可能存在的關(guān)鍵蛋白，初步驗證其生物學(xué)功能。本研究通過對RSK4和其變異體RSK4m的相互作用蛋白的研究，可以為我們初

3、步了解其獨特的蛋白功能和作用機(jī)制，從而為進(jìn)一步闡明乳腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制及尋找乳腺癌治療新靶點開辟新思路和新途徑。
　　方法:分別構(gòu)建了帶有串聯(lián)親和標(biāo)簽（兩個strepⅡ標(biāo)簽和一個FLAG標(biāo)簽）的RSK4和RSK4m過表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染到RSK4低表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中，運用串聯(lián)親和純化技術(shù)(tandem affinity purification，TAP)，得到與RSK4或RSK4m相互作用的蛋白復(fù)合物，然后對所得的蛋

4、白復(fù)合物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和分析，應(yīng)用生物信息學(xué)分析方法（GO和IPA分析），分別對RSK4和RSK4m的相互作用蛋白進(jìn)行功能注釋和繪制了蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。為了確認(rèn)生物信息學(xué)分析結(jié)果，我們還利用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，CO-IP)對其中PRMT5（蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5）蛋白與RSK4的相互作用關(guān)系進(jìn)行驗證。
　　研究結(jié)果:本研究通過兩個StrepⅡ標(biāo)簽和單個FLAG標(biāo)簽為基礎(chǔ)的串聯(lián)親和純化技術(shù)

5、（SF-TAP）聯(lián)合運用nano LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)分別分離和鑒定出82個RSK4相關(guān)的相互作用蛋白，137個RSK4m相關(guān)的相互作用蛋白。應(yīng)用生物信息學(xué)分析方法（GO和IPA分析），分別對RSK4和RSK4m的相互作用蛋白進(jìn)行功能注釋和繪制了蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。 GO(Gene Ontology)分析結(jié)果: RSK4 wt或RSK4m的互作蛋白參與細(xì)胞的多種生理活動，比如:tRNA代謝(tRNA metabolic pro

6、cess)，核糖體蛋白復(fù)合物的生物合成(ribonucleoprotein complex biogenesis)，氨基酸的活化(amino acid activation)和蛋白折疊(protein folding)等，這些互作蛋白絕大部分都位于細(xì)胞質(zhì)中，與RSK4本身位于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮生物功能是一致的。IPA（Ingenuity Pathway Analysis）分析結(jié)果:將鑒定到的互作蛋白經(jīng)過核心數(shù)據(jù)分析方法(Core An

7、alyze dateset)，分別得到RSK4 wt和RSK4m各自三個富集度最高的信號通路和蛋白互作網(wǎng)絡(luò):①RSK4 wt和RSK4m主要參與了核糖體生物合成，互作蛋白組網(wǎng)絡(luò)中的PRMT5、STAT3、HSP90AB1、ATP5B、RPL核糖體亞基系列蛋白等與細(xì)胞中核糖體生物合成密切相關(guān);②RSK4 wt和RSK4m的互作蛋白均參與細(xì)胞前體RNA的處理，互作蛋白中的HNRNPH1、HNRNPK、HNRNPM屬于hnRNPs(heter

8、ogeneousnuclear ribonucleproteins)家族，是RNA結(jié)合蛋白，能與mRNA前體相互作用，影響mRNA前體的處理以及mRNA代謝和運輸;③RSK4 wt和RSK4m主要參與染色體的重組與代謝，相互作用蛋白STK38、STK38L、MOB2和DDX3X參與調(diào)節(jié)中心體的復(fù)制和有絲分裂期染色質(zhì)的重組。綜合GO分析和IPA分析的結(jié)果，表明RSK4 wt和RSK4m參與了多種細(xì)胞活動，擁有多種不同的生物學(xué)功能。RSK4

9、m的相互作用蛋白更多，并且參與更多的生物通路。同時，CO-IP證實了其中的蛋白如PRMT5與RSK4存在相互作用關(guān)系，表明PRMT5可能可以通過甲基化RSK4從而抑制RSK4對細(xì)胞生長的抑制作用。
　　結(jié)論:RSK4和RSK4m存在與其相互作用蛋白，相互作用蛋白復(fù)合物主要參與了核糖體生物合成、前體RNA處理和染色體的重組與代謝，并介導(dǎo)多種生物學(xué)功能調(diào)控，特別是有關(guān)細(xì)胞衰老的調(diào)控;而且RSK4和RSK4m有著不同相互作用蛋白，其調(diào)控