單環(huán)刺螠內(nèi)臟蛋白酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)的研究.pdf

1、oAgriculturalUniversityTheThesisofProfessionalMasterPurificationandCharacterizationofProteasenTT●■■●IromUUrechZSumctnctusVlSCeraGraduatewithProfessionalMasterDegree：LiuShuangshuangMentor：ChenHaihuaSecondMentor：GongChunbo

2、ⅪpeofProfessionalDegree：MasterofEngineeringAcademicfield：FoodEngineering青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要單環(huán)刺蜢(Urechisunicinctus)，俗稱海腸或海腸子，其個(gè)體肥大、肉味鮮美，內(nèi)臟中富含蛋白質(zhì)、長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸及多種有益化學(xué)元素，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及良好的開(kāi)發(fā)利用前號(hào)。目前，單環(huán)刺蜢多以鮮銷為主，內(nèi)臟通常被丟棄，造成資源的極大浪費(fèi)。因此，本文以單環(huán)刺蛙

3、內(nèi)臟為原料，探索蛋白酶的提取條件，并對(duì)從中提取的蛋白酶進(jìn)行分離純化，探索其酶學(xué)性質(zhì)與酶切規(guī)律，以期為蛋白酶的深層次利用與開(kāi)發(fā)，提供理論基礎(chǔ)與新思路：同時(shí)，充分利用海洋資源，減少環(huán)境污染，彌補(bǔ)單環(huán)刺蜢在此方面的研究空白。主要結(jié)論如下：l本文以酶比活和酶活為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化粗蛋白酶包括液固比、浸提時(shí)間、浸提溫度和pH值4個(gè)因素在內(nèi)的提取工藝條件，探索單環(huán)刺蜢內(nèi)臟提取粗蛋白酶的最佳提取條件。結(jié)果表明，單環(huán)刺蜢內(nèi)臟粗蛋白酶

4、提取的最優(yōu)工藝：液固比220：1、浸提時(shí)間30rain、溫度12℃、pH80，在此工藝條件下，單環(huán)刺蜢粗蛋白酶酶比活為339U／mg。2本章以單環(huán)刺蜢內(nèi)臟為原料，對(duì)提取的蛋白酶的分離純化條件及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，對(duì)比三種方法的純化結(jié)果，初步純化條件選取硫酸銨純化：經(jīng)硫酸銨純化、SephadexG100凝膠過(guò)濾層析、DEAE52陰離子交換層析后得到單環(huán)刺蜢內(nèi)臟蛋白酶純品(蛋白酶LNP2)：經(jīng)SDSPAGE電泳及HPLC顯示該酶為

5、電泳純與色譜純，分子量約為59KDa。蛋白酶UqP2最適作用溫度為50℃，最適pH范圍為6~8。絲氨酸蛋白酶抑制劑(PMSF)與金屬蛋白酶抑制劑(EDTA)對(duì)蛋白酶LNP2的酶活均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，初步推測(cè)該酶為絲氨酸蛋白酶，其活性中心可能含有金屬離子：13巰基乙醇([3ME)與二硫蘇糖醇(DTT)抑制作用不明顯。Ca2、zn2、Ba2均隨著濃度的增加對(duì)酶活的抑制作用增強(qiáng)，Zn2的抑制作用最明顯，F(xiàn)e2在低濃度下對(duì)該酶具有較明顯的激

6、活作用。因此，初步推測(cè)該酶活性中心可能含有Fe2。3本章以從單環(huán)刺蜢內(nèi)臟中分離純化的蛋白酶LNP2為研究對(duì)象，以具有內(nèi)切特性的中性蛋白酶為參比，以酶解液水解度、游離氨基酸與肽分子量分布為指標(biāo)，確定蛋白酶U咿2的酶切規(guī)律。結(jié)果表明，三種酶解方式所得酶解液的水解度(DII)，雙酶最大，中性蛋白酶次之，蛋白酶LNP2最低：蛋白酶LNP2與中性蛋白酶酶切位點(diǎn)數(shù)相似，酶切作用位點(diǎn)具有互補(bǔ)性：蛋白酶LNP2可以更多地將豆粕底物水解為短肽或小肽。綜合