鱖魚胰蛋白酶分離純化、性質(zhì)鑒定及分子克隆.pdf

1、胰蛋白酶(Trypsin，EC 3.4.21.4)是絲氨酸蛋白酶家族中一種專門水解蛋白質(zhì)賴氨酸(Lys)殘基和精氨酸(Arg)殘基的肽鏈內(nèi)切酶，在魚體內(nèi)起著重要的生理和消化功能。在低溫下仍然具有高活性的魚體胰蛋白酶對食品加工行業(yè)具有重要意義。但是，目前國內(nèi)外關于淡水魚胰蛋白酶的報道很少。本課題首次以淡水鱖魚為研究對象，對其幽門垂胰蛋白酶進行了分離純化，研究其酶學性質(zhì)，并對胰蛋白酶進行了分子克隆，為今后研究淡水魚類胰蛋白酶的生理功能、消化

2、功能以及這類酶在食品加工中的應用提供了理論基礎。 本課題分離純化胰蛋白酶的方法包括硫酸銨分級鹽析、DEAE-Sephacel陰離子交換層析、Sephacryl S-200凝膠過濾層析、Q-Sepharose陰離子交換層析和SP-Sepharose陽離子交換層析等。本研究得到了兩種類型的胰蛋白酶即陰離子型胰蛋白酶Trypsin A和陽離子型胰蛋白酶Trypsin B。 SDS-PAGE、Native-PAGE和Casein

3、-zymography結果表明Trypsin A和Trypsin B 都得到了高度純化并且都是單體結構。SDS-PAGE顯示Trypsin A和 Trypsin B的分子量分別為21kDa和21.5 kDa。用Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物，二者的最適溫度分別為35和40 ℃，最適pH值均為pH8.5。熱穩(wěn)定性與pH值穩(wěn)定性實驗表明，Trypsin A和Trypsin B 在45 ℃以下加熱30 min可保持其活性，pH值

4、的耐受范圍為4.5至11.0。抑制劑實驗表明絲氨酸類蛋白酶抑制劑都可以對這兩種胰蛋白酶強烈抑制，并且兩種酶的抑制效果相似。底物特異性實驗表明Trypsin A和Trypsin B對熒光底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA的分解能力最強。金屬離子實驗表明，這兩種胰蛋白酶可被一定濃度范圍的Ca2+和Mg2+離子激活，而被Fe2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Al3+、Ba2+和Co2+離子在一定程度上抑制。動力學實驗表明，以Boc-

5、Phe-Ser-Arg-MCA為底物，Trypsin A與Trypsin B的Km值分別為2.18和1.88 μM，所對應的KcatS值分別為81.6和111.3 s-1。免疫印跡實驗表明，鱖魚胰蛋白酶可以和抗鯉魚胰蛋白酶抗體呈陽性反應。氨基酸測序結果表明，Trypsin B的N-末端氨基酸序列為IVGGYECEAH，該序列和來自其它魚氨基酸序列有高度的同源性。 在分子克隆工作中，以胰蛋白酶保守位點及已測序的胰蛋白酶Trypsi

6、n B的N-末端氨基酸序列為依據(jù)設計引物，利用3' RACE、5' RACE及RT-PCR的方法得到了兩條編碼鱖魚胰蛋白酶的基因序列，并分別命名為TRS-A與TRS-B，基因序列的GenBank 登錄號分別為EU688996和EU688997，相應的氨基酸序列GenBank登錄號為ACD70339與ACD70340。 TRS-A的cDNA全長為869 bp，該序列包括一個23 bp的5'非編碼區(qū)，729 bp的開放閱讀框和117

7、 bp的3'非編碼區(qū)，開放閱讀框編碼242個氨基酸，其中222個氨基酸組成成熟蛋白區(qū)域，有15個氨基酸的信號肽和5個氨基酸組成的激活肽，成熟蛋白分子量為24111.16 Da。TRS-B的cDNA全長為885 bp，該序列包括23 bp的5'非編碼區(qū)，729 bp的開放閱讀框和133 bp的3'非編碼區(qū)。和TRS-A一樣，TRS-B的開放閱讀框編碼242個氨基酸，其中222個氨基酸組成成熟蛋白區(qū)域，有15個氨基酸的信號肽和5個氨基酸組成