單環(huán)刺螠纖溶酶的分離純化及單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅲ的藥效學研究.pdf

1、血栓性疾病（thrmobotic disease，TD）嚴重威脅著人類的生命健康，其發(fā)病率高居各種疾病之首，危害人體心、腦和肺的血管系統(tǒng)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，自2004年至今，全世界每年都有1700多萬人死于心腦血管病，而我國心腦血管疾病患者已經(jīng)超過2.7億人，每年死于心腦血管疾病的患者多達300萬以上。
　　溶栓療法被認為是治療血栓性疾病最為有效的方法，溶栓藥物也早已經(jīng)廣泛應用于各種血栓性疾病的治療。以尿激酶、t-PA為代表的臨

2、床溶栓劑效果顯著，但也存在許多副作用，且價格不菲。因此，人們一直在努力從生物界尋找著理想溶栓物質(zhì)的來源?；诤Ｑ笊锾烊换钚晕镔|(zhì)相比于陸生生物活性物質(zhì)的諸多優(yōu)勢，本實驗室經(jīng)過多年積累，從海洋無脊椎動物單環(huán)刺螠（Urchis unicinctus）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離純化出了一系列具有纖溶活性的蛋白酶，并以其分子量由大及小命名為單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅰ（45.1 kDa）、Ⅱ（26.7 kDa）、Ⅲ（20.8 kDa）和Ⅳ（10-11 kDa）。本研究

3、利用離子交換色譜及凝膠過濾色譜等柱層析技術(shù)制備了純度較高的單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅰ（45.1 kDa）和Ⅲ（20.8 kDa），并以單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅲ為研究對象，系統(tǒng)考察了其生化性質(zhì)及酶學性質(zhì)，評價了其生物安全性和體內(nèi)外抗凝、溶栓活性?，F(xiàn)將主要研究結(jié)果分述如下：
　　1.采用多種分離和純化方法相結(jié)合，包括透析、冷凍干燥、凝膠柱層析和陰離子交換柱層析，獲得了純度較高的單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅰ和Ⅲ，兩種蛋白在Native-PAGE和SDS-PAGE中均

4、顯示單一條帶，說明兩者成分均一且均為單鏈蛋白，分子量分別為45.1 kDa和20.8 kDa。
　　2.對單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅲ進行了系統(tǒng)地生化性質(zhì)及酶學性質(zhì)研究：UFEⅢ是一種絲氨酸蛋白酶，其N末端12個氨基酸依次為：IIGGSQAAITSY。UFEⅢ的等電點在7.2附近。每mg UFEⅢ的總纖溶酶活力為1461.5個尿激酶活力單位，其中包含692.3個直接降解纖維蛋白（原）的活力單位和769.2個纖溶酶原激酶的活力單位。UFEⅢ水解

5、纖維蛋白原的方式為：A?鏈>B?鏈>?鏈。UFEⅢ在60℃以下穩(wěn)定，最適反應溫度在55-60℃之間；UFEⅢ在pH6-10之間活力較高，最適pH值為8.5。Mn2+和Mg2+能提升UFEⅢ酶活力，Cu2+能顯著地抑制UFEⅢ酶活力。另外，絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF和SBTI能顯著抑制UFEⅢ酶活力。以酪蛋白為底物，UFEⅢ的酶促反應動力學常數(shù)：Vmax=42.92μg/min·ml，Km=1.06 mg/ml。
　　3.單環(huán)刺螠纖

6、溶酶Ⅲ不引起機體溶血，無明顯的出血反應，無小鼠全身急性毒性。
　　4.單環(huán)刺螠纖溶酶Ⅲ在體外有較好的抗凝、溶栓活性，對紅細胞無害；在3 h內(nèi)，其體外溶栓率達60.5％。在動物體內(nèi)，UFEⅢ能顯著延長小鼠凝血時間，UFEⅢ高、中、低三個劑量組對大鼠頸動脈血栓形成的抑制率分別達到70.2%，54.0%和36.4%，表現(xiàn)出了良好的抗凝活性；在 FeCl3誘導兔頸動脈血栓模型和結(jié)扎誘導大鼠下腔靜脈血栓模型中，UFEⅢ能部分溶解造模動物血管