高表達(dá)MMP9對大鼠皮膚成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及TIMP1作用的初步探討.pdf

1、背景：糖尿病足是指與下肢遠(yuǎn)端神經(jīng)異常和不同程度的周圍血管病變相關(guān)的足部感染、潰瘍和(或)深層組織破壞。由于糖尿病足發(fā)病率高、治療費(fèi)用貴、傷口難以愈合且容易復(fù)發(fā),其發(fā)病機(jī)制和治療方法一直是基礎(chǔ)與臨床研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase9,MMP9)與糖尿病足潰瘍之間關(guān)系密切。Muller等人發(fā)現(xiàn),糖尿病足患者潰瘍滲出液中MMP9水平較正常人升高。本課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn)：

2、①糖尿病大鼠皮膚組織尚未受創(chuàng)時(shí),就已經(jīng)出現(xiàn)皮膚“隱性損害”,而且與高水平的MMP9關(guān)系密切；②與非糖尿病大鼠相比,糖尿病大鼠皮膚傷口愈合過程MMP9的水平明顯升高。目前普遍認(rèn)為,高水平的MMP9主要是通過過度降解細(xì)胞外基質(zhì)、生長因子、生長因子受體、整合素及其受體,以及加重傷口局部炎癥反應(yīng)等方面來減慢糖尿病足潰瘍的愈合。對于MMP9是否還可以通過影響皮膚成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為來影響傷口愈合,目前國內(nèi)外未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。皮膚成纖維細(xì)胞是傷口

3、修復(fù)的重要效應(yīng)細(xì)胞,任何能夠影響其生物學(xué)特性的因素最終都將會影響到傷口的愈合。為探討MMP9在糖尿病足傷口愈合中可能的新機(jī)制,本課題選擇大鼠皮膚成纖維細(xì)胞為研究對象,體外給予不同濃度的糖和同型半胱氨酸刺激,制備高分泌MMP9細(xì)胞模型,探討高分泌MMP9情況下皮膚成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的變化,同時(shí)觀察通過組織金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP1)抑制MMP9的活性能否改善成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為。本課題的研究將為探討糖尿病皮膚傷口的難愈機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)

4、依據(jù),也將為尋找糖尿病足的治療方法提供新的思路。
　　 目的：⑴建立體外高表達(dá)MMP9皮膚成纖維細(xì)胞模型,為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。⑵觀察高表達(dá)MMP9皮膚成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為和TIMP1的干預(yù)效果,以探討MMP9對大鼠皮膚成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　 方法：①分別用正糖(5.5 mmol/L)、高糖(22.0mmol/L)和高糖(22.0mmol/L)+高同型半胱氨酸(100μmol/L)培養(yǎng)大鼠皮膚成纖維細(xì)胞,檢

5、測各組細(xì)胞MMP9mRNA(Realtime RT-PCR法)和蛋白(ELISA法)表達(dá)量,以及MMP9蛋白的活性(明膠酶譜法),篩選出MMP9表達(dá)量及活性最高的組作為模型組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。②采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖功能；CCK-8檢測細(xì)胞活力；ELISA法檢測細(xì)胞膠原(羥脯氨酸)分泌能力；劃痕實(shí)驗(yàn)評價(jià)細(xì)胞橫向遷移能力；Transwell法評價(jià)細(xì)胞縱向遷移能力。
　　 結(jié)果：⑴高糖+高同型半胱氨酸組MMP9 mRNA的表達(dá)量(7

6、.05±1.02),蛋白的表達(dá)量(206.9±33.6)pg/ml以及MMP9蛋白活性(1.47±0.13)均明顯高于正糖組[分別為(1.00±0.00)、(40.4±5.9)pg/ml、(0.57±0.12)]和高糖組[分別為(2.83±0.91)、(73.7±5.8)pg/ml、(0.92±0.11)](P均<0.01),故選擇高糖+高同型半胱氨酸組作為高表達(dá)MMP9皮膚成纖維細(xì)胞模型進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。⑵高糖+高同型半胱氨酸組大鼠皮膚成

7、纖維細(xì)胞S期的比例(6.54±0.29)％、增殖指數(shù)(11.3±0.6)％、細(xì)胞活力(1.35±0.12)、膠原(羥脯氨酸)分泌量(352.8±60.6)pg/ml、6h橫向遷移率(21.3±2.1)％和縱向遷移細(xì)胞數(shù)(71.2±3.8)均較正糖組明顯減少(P均<0.01)。⑶TIMP1干預(yù)后,大鼠皮膚成纖維細(xì)胞MMP9 mRNA(6.84±1.18)和蛋白(202.4±26.9)pg/ml的表達(dá)量與非干預(yù)組[分別為(7.05±1.02

8、)和(206.9±33.6)pg/ml]比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MMP9蛋白活性(0.43±0.13)卻較非干預(yù)組(1.47±0.13)明顯降低(P<0.01)。TIMP1干預(yù)后,大鼠皮膚成纖維細(xì)胞S期的比例(7.75±0.27)％、增殖指數(shù)(12.5±0.5)％、細(xì)胞活力(1.64±0.14)、膠原(羥脯氨酸)分泌量(828.6±58.9)pg/ml、6h橫向遷移率(31.5±2.7)％和縱向遷移細(xì)胞數(shù)(85.3±3.7