PAI-1-RNAi對SD大鼠皮膚成纖維細胞增殖的影響.pdf

1、目的：本實驗探討應(yīng)用RNA干擾（RNA Interference, RNAi）技術(shù)下調(diào)纖溶酶原激活抑制劑-1（Plasminogen Activator Inhibitor-1，PAI-1）表達對SD大鼠皮膚成纖維細胞（fibroblast）增殖的影響，通過體外實驗從細胞水平探究 PAI-1對成纖維細胞增殖、轉(zhuǎn)化的作用，進一步為前期動物實驗 PAI-1 siRNA可改善 SD大鼠瘢痕疙瘩模型提供理論依據(jù)，為瘢痕疙瘩（keloid）基因治

2、療開辟新思路。
　　方法：
　　1.SD大鼠皮膚成纖維細胞培養(yǎng)
　　采用組織塊培養(yǎng)法獲取原代 SD大鼠皮膚成纖維細胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)去除上皮細胞、紅細胞等雜質(zhì)成分，獲取單一成纖維細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞生長及形態(tài)變化。
　　2.免疫細胞化學(xué)法鑒定細胞
　　應(yīng)用免疫細胞化學(xué)法，通過檢測波形蛋白表達是否陽性，鑒定所培養(yǎng)的細胞是否為成纖維細胞。
　　3.PAI-1 siRNA轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的成纖維細胞，并進行

3、實驗分組
　　利用脂質(zhì)體（Lipofectamine2000）轉(zhuǎn)染 siRNA至體外培養(yǎng)傳代至第六代的成纖維細胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染不同設(shè)置實驗分組為：轉(zhuǎn)染 PAI-1 siRNA的實驗組、轉(zhuǎn)染 NC siRNA的陰性對照組、不進行轉(zhuǎn)染的空白對照組。
　　4.應(yīng)用RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染24小時，PAI-1 mRNA、TGF-β1 mRNA的表達。
　　5.應(yīng)用 Western blot法測定轉(zhuǎn)染48小時，PAI-1、AKT、ER

4、K、p-AKT、p-ERK蛋白的表達。
　　6.應(yīng)用臺盼藍染色法計數(shù)細胞并繪制曲線。
　　分別于轉(zhuǎn)染24小時、48小時、72小時，制備細胞懸液進行臺盼藍染色，鏡下計數(shù)細胞總數(shù)以及未被染液染色的細胞總數(shù)（或被染色的細胞總數(shù)），以培養(yǎng)時間為橫坐標，細胞計數(shù)為縱坐標，繪制成纖維細胞生長曲線及成纖維細胞成活率曲線。
　　7.應(yīng)用CCK-8測定成纖維細胞的增殖活力繪制曲線。
　　分別于轉(zhuǎn)染24小時、48小時、72小時加入C

5、CK-8試劑，孵育4小時后，通過使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度（OD值），根據(jù)計算公式，得出細胞的OD值、細胞增殖抑制百分率（％）。以培養(yǎng)時間為橫坐標，細胞的OD值為縱坐標繪制生長曲線；以培養(yǎng)時間為橫坐標，細胞增殖抑制百分率（%）為縱坐標繪制增殖抑制率曲線。
　　8.統(tǒng)計學(xué)處理
　　本實驗所有數(shù)據(jù)應(yīng)用 SPSS21.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)為計量資料，采用均數(shù)±標準差表示，統(tǒng)計結(jié)果以 P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。進行數(shù)據(jù)分析

6、之前，先分析數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性。若數(shù)據(jù)服從正態(tài)性分布且方差齊時，則多樣本比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較采用 SNK-q檢驗；若不服從正態(tài)性分布或方差不齊，則選用秩和檢驗中的Kruskal-Wallis H檢驗，組間比較采用 Mann-Whitney U檢驗。
　　結(jié)果：
　　1.采用組織塊培養(yǎng)法成功獲取 SD大鼠皮膚成纖維細胞，經(jīng)傳代至第5-6代可獲取單一成分的成纖維細胞；
　　2.

7、采用免疫細胞化學(xué)法染色檢測波形蛋白，鏡下可見培養(yǎng)細胞胞漿顯示棕色或棕黃色顆粒，細胞核未見著色，即波形蛋白抗體染色陽性，證實實驗所培養(yǎng)細胞是成纖維細胞；
　　3.應(yīng)用 Real time PCR檢測 PAI-1成功轉(zhuǎn)染成纖維細胞，成纖維細胞中 PAI-1 mRNA、 TGF-β1 mRNA表達明顯降低，三組間 RQ值總體均數(shù)不同或不全相同（P＜0.05），實驗組與陰性對照組間、實驗組與空白對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而

8、陰性對照與空白組間無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；
　　4.應(yīng)用 Western blot檢測成功轉(zhuǎn)染 PAI-1 siRNA，成纖維細胞中PAI-1、p-AKT、p-ERK蛋白的表達明顯下調(diào)，實驗組與陰性對照組間、實驗組與空白對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而陰性對照與空白組間無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而對去磷酸化狀態(tài) AKT、ERK無影響，三組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；
　　5.臺盼藍染色后計數(shù)細

9、胞，繪制成纖維細胞生長曲線及成活率曲線可見隨著時間進展轉(zhuǎn)染 PAI-1 siRNA后成纖維細胞數(shù)量增長速度較陰性對照組與空白對照組明顯減慢，細胞成活率顯著降低；
　　6.采用 CCK-8試劑測定繪制成纖維細胞生長曲線及成纖維細胞增殖抑制率曲線，觀察走勢，與對照組相比可見轉(zhuǎn)染 PAI-1 siRNA后的成纖維細胞增殖活力低，增殖抑制率較高。
　　結(jié)論：
　　本實驗研究成功獲取原代 SD大鼠皮膚成纖維細胞，選取傳代至第五或