腫瘤標(biāo)志物中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(NGAL)與鈣調(diào)磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)的生物學(xué)功能研究.pdf

1、背景:乳腺癌是威脅女性生存的主要腫瘤之一。NGAL為lipocalin蛋白家族的新成員,具有典型的β折疊桶狀保守結(jié)構(gòu),是一種25kD的分泌型糖蛋白。因其結(jié)合配體的多樣性,NGL在諸如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、腫瘤遷移與侵襲以及EMT轉(zhuǎn)變等眾多生理與病理學(xué)過(guò)程中扮演著重要的角色。大量研究結(jié)果表明NGAL是一種新的腫瘤標(biāo)志物,為潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。NGAL的生物學(xué)功能及其表達(dá)調(diào)控模式因腫瘤種類(lèi)及其分型而有所不同。研究表明在乳腺癌中NGAL的表達(dá)亦與乳

2、腺癌種類(lèi)及亞型有關(guān),其表達(dá)受雌激素受體ER以及轉(zhuǎn)錄因子NFAT的調(diào)控。在機(jī)體內(nèi)部基因表達(dá)調(diào)控是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程,NGAL在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的異質(zhì)性正顯示了基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性。C/EBPζ為C/EBP家族轉(zhuǎn)錄因子成員,對(duì)C/EBP家族其他成員的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性起著負(fù)調(diào)控的作用。已有研究表明在白血病等腫瘤中C/EBPζ表達(dá)明顯降低。結(jié)合文獻(xiàn)以及生物信息學(xué)分析我們?cè)贜GAL的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了潛在的C/EBPζ作用位點(diǎn),但C/EBPζ是否參與NGA

3、L的表達(dá)調(diào)控尚不明確。鈉氫交換體1(NHE1,Na+/H+exchanger1)對(duì)細(xì)胞的pHi起著重要的調(diào)節(jié)作用,腫瘤細(xì)胞內(nèi)的堿化作用是腫瘤進(jìn)程中的標(biāo)志性事件之一。NHE1介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞內(nèi)pHi升高是否對(duì)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)C/EBPζ以及NGAL的表達(dá)具有調(diào)控作用仍不明了。
　　 目的:以ER受體陰性、具高侵襲能力的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株為研究對(duì)象,分析轉(zhuǎn)錄因子C/EBPζ以及NGAL基因在其轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)作用及其機(jī)制。在此

4、基礎(chǔ)上闡明NHE1以及C/EBPζ對(duì)NGAL基因的調(diào)控機(jī)制。
　　 方法:采用實(shí)時(shí)定量PCR、western blotting技術(shù)檢測(cè)NGAL在遷移能力不同的細(xì)胞系中的差異性表達(dá)；通過(guò)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPζ以及基因沉默技術(shù)干擾NGAL基因分別研究C/EBPζ以及NGAL在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)作用。酶譜法檢測(cè)過(guò)表達(dá)C/EBPζ以及干擾NGAL后MMPs蛋白活性的改變。構(gòu)建NGAL啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)

5、研究C/EBPζ以及NHE1對(duì)NGAL轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。采用WNT以及NF-κB通路的抑制劑分析了相關(guān)信號(hào)通路在NGAL介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)作用。
　　 結(jié)果:相比低遷移能力的ER+的乳腺癌細(xì)胞系MCF7,MDA—MB-231細(xì)胞系中NGAL基因的表達(dá)顯著升高,顯示了NGAL對(duì)轉(zhuǎn)移能力的潛在調(diào)控。過(guò)表達(dá)C/EBPζ以及干擾NGAL基因后MDA-MB-231細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力明顯受到抑制,細(xì)胞的MMPs家族蛋白的表達(dá)及其活性均受到影

6、響。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)C/EBPζ對(duì)NGAL基因啟動(dòng)子的活性有明顯的調(diào)節(jié)作用。采用NHE1的選擇性抑制劑Cariporide抑制其活性后,MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力受到明顯抑制。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)這種抑制作用部分源于C/EBPζ升高所引起NGAL表達(dá)降低來(lái)完成的。
　　 結(jié)論:C/EBPζ通過(guò)調(diào)節(jié)NGAL啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)抑制NGAL的表達(dá),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其對(duì)MDA—MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控。NHE1以及基質(zhì)金屬