中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)與Tamm-Horsfall蛋白在慢性腎臟病(CKD)腎小管損傷中的診斷意義.pdf

1、隨著人口老齡化的不斷增加及人們生活環(huán)境的日益變化，慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)包括糖尿病腎病、高血壓腎病、狼瘡腎病等繼發(fā)性腎病和原發(fā)性腎病的發(fā)病率逐漸升高。慢性腎臟病的病理進展比較緩慢而且具有不可逆性，早期腎臟損害的臨床癥狀不明顯。研究發(fā)現(xiàn)THP(Tamm-HorsfallProtein，THP)和其他新型腎功能指標如:中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(Neutrophil gelatinase-a

2、ssociated lipocalin，NGAL)、血清胱抑素C(Cystatin C，CysC)、血清β2微球蛋白、血清及尿液視黃醇結(jié)合蛋白等在腎臟損傷早期即可發(fā)生變化，而且尿液NGAL和THP的水平變化可反映慢性腎臟病早期腎小管損傷。但是，目前檢測尿液THP的方法大多為放射免疫法，具有一定的危險性和污染性。本研究通過THP單克隆抗體的制備、純化、鑒定，最終建立了THP的酶聯(lián)免疫試驗(Enzyme linked immunosorbe

3、nt assay，ELISA)檢驗方法。收集在北京空軍總醫(yī)院風濕腎病科住院的慢性腎臟病患者，檢測其尿液THP的含量，并采用日立7600全自動生化分析儀檢測患者尿液NGAL、尿液NAG、血清CysC、血清β2-MG、血清及尿液視黃醇結(jié)合蛋白等腎功能指標含量。根據(jù)2009年改善全球腎臟疾病結(jié)局組織(Kidney Disease:Improving Global Outcomes，KDIGO)新公布的臨床實踐指南，結(jié)合eGFR值將慢性腎病患者

4、進行分期，利用統(tǒng)計學方法分析CKD患者在不同分期中THP及各指標的含量變化。分析新型腎臟指標如尿液NGAL、THP與傳統(tǒng)腎功能指標如Scr、Urea等的相關(guān)性，繪制受試者特征性工作曲線判斷各指標在CKD早期診斷中的準確性，并聯(lián)合檢測尿液NGAL和THP，觀察聯(lián)合預測因子在CKD腎小管損傷診斷中的準確性，為CKD的早期診斷及臨床分期提供實驗室依據(jù)。
　　研究目的：
　　第一，制備THP單克隆抗體，了解單克隆抗體制備的實驗原理、

5、主要步驟和實驗方法。掌握細胞的復蘇、培養(yǎng)、腹水純化、抗體效價鑒定等實驗室基本技術(shù)。第二，建立檢測尿液THP的ELISA方法。第三，檢測尿液NGAL、尿NAG、血清CysC、血清β2-MG等腎功能指標。第四，聯(lián)合檢測尿NGAL與尿THP并分析聯(lián)合預測因子在早期CKD診斷中的敏感度及特異性。為早期診斷CKD，給予早期干預治療延緩CKD患者的病理進展提供可靠的實驗室依據(jù)。
　　研究方法：
　　第一，已經(jīng)利用基因工程技術(shù)制備好抗原，

6、并以純化的重組THP片段蛋白作為免疫原免疫小鼠，待小鼠血液抗體效價達到要求后，取脾臟。采用常規(guī)的細胞融合方法方法，使用細胞融合劑PEG1500將脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，獲得具有分泌THP抗體的雜交瘤細胞放入液氮中保存。第二，將能夠分泌3B9和4E4抗體的兩株雜交瘤細胞復蘇、培養(yǎng)、注入小鼠腹腔制備腹水，并將腹水用ProteinG方法進行純化、檢測抗體效價、用辣根過氧化物酶標記抗體并檢測偶聯(lián)后的效價。第三，建立檢測患者尿液THP含量的雙

7、抗體夾心的ELISA檢測方法。第四，采用日立7600全自動生化分析儀檢測CKD患者的尿NGAL、尿NAG、血清CysC、血清β2-MG等腎功能指標，并收集49名健康體檢人員（尿常規(guī)正常，尿蛋白陰性）作為對照組。最后對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析處理。
　　研究結(jié)果：
　　第一，利用兩株能夠穩(wěn)定分泌THP單克隆抗體的雜交瘤細胞株制備腹水后，腹水效價均高于1∶720000，經(jīng)ProteinG方法純化得到THP單克隆抗體純度大于90％，其抗

8、體效價為4.1ng/ml左右。偶聯(lián)后用ELISA方法檢測4E4-HRP的效價為1∶720000，可用于檢測臨床標本。第二，統(tǒng)計數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，尿液THP從CKD2期即與對照組和1期出現(xiàn)明顯差異。尿液NGAL從CKD3a期開始于對照組比較有統(tǒng)計學差異。說明尿液NGAL與尿液THP在CKD早期就出現(xiàn)變化，比傳統(tǒng)指標Scr、Urea等指標更為敏感。第三，在繪制的ROC曲線中顯示尿液NGAL的準確性大于尿液THP，兩者的聯(lián)合預測因子敏感度及特異性

9、更高，ROC曲線下的面積為0.953。尿液THP與Scr、Urea呈負相關(guān)，隨著腎小球濾過率的降低而降低。其他指標如:尿液NGAL、尿液NAG、血清CysC等與Scr、Urea呈正相關(guān)，隨著腎小球濾過率的降低而增高。
　　研究結(jié)論：
　　第一，雜交瘤細胞復蘇培養(yǎng)后能穩(wěn)定分泌THP單克隆抗體，在體外傳代后分泌抗體的能力沒有改變，說明具有很好地穩(wěn)定性。第二，制備的THP蛋白單克隆抗體能夠很好的識別天然THP，表明單克隆抗體的特異