糖基化終末產(chǎn)物對(duì)人外周血內(nèi)皮組細(xì)胞生物學(xué)特性的影響研究.pdf

1、目的：糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸與葡萄糖或其他還原單糖非酶反應(yīng)生成的穩(wěn)定的共價(jià)化合物，它可通過損傷血管內(nèi)皮、促進(jìn)白細(xì)胞粘附、增加血小板聚集和刺激血管平滑肌增殖等機(jī)制，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病血管并發(fā)癥、尿毒癥等疾病的發(fā)生發(fā)展。大量研究表明，AGEs在動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病血管病變、尿毒癥等多種血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。AGEs在血管病變中

2、的作用機(jī)理主要是：損傷血管內(nèi)皮；促進(jìn)白細(xì)胞粘附、聚集及活化；刺激血管平滑肌細(xì)胞增值；加快血小板聚集和血栓形成。血管病變是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥，也是當(dāng)今因糖尿病致殘致死的主要原因之一。糖尿病并發(fā)癥主要以糖尿病大血管病變和微血管病變最為常見，是決定糖尿病患者預(yù)后的最主要因素，是導(dǎo)致糖尿病致死率和致殘率增高的最主要原因。因此，目前各種糖尿病并發(fā)癥的防治已成為世界醫(yī)學(xué)糖尿病研究的重要課題。AGEs在糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)病中起重要作用。研究表明

3、，內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)在血管新生、血管內(nèi)皮修復(fù)和促進(jìn)傷口愈合方面具有重要作用。但是，外周血EPCs在其分化成熟過程中，如果功能受損或過早凋亡，都會(huì)影響到血管內(nèi)膜重新內(nèi)皮化和新血管形成。1型糖尿病患者的EPCs數(shù)量較正常對(duì)照組低44％，且與糖化血紅蛋白(HbAlc)水平有關(guān)，同時(shí)體外血管新生能力檢測(cè)證明EPCs功能減弱，其EPCs在培養(yǎng)基支持形成內(nèi)皮血管的能力明顯下降。合并有糖尿

4、病并發(fā)癥的1型糖尿病患者的血漿AGEs水平遠(yuǎn)高于健康人群。目前，國內(nèi)外尚無AGEs對(duì)EPCs功能及其凋亡方面的研究。因此，研究AGEs能否影響人循環(huán)EPCs生物學(xué)特性很有必要。 方法：采取健康人外周血抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離外周血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞，在含有體積分?jǐn)?shù)為0.2胎牛血清、20μg/L的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和4μg/L的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)和擴(kuò)增，由FITC-UEA-I和D

5、il-acLDL熒光雙染鑒定。加入不同濃度糖基化終末產(chǎn)物-人血清白蛋白(advanced glycation end products-human serum albumin，AGEs-HSA)培養(yǎng)48h，然后分別采用MTT法、Boyden小室測(cè)定來觀察EPCs的增殖、遷移能力；以人纖維連接蛋白(human fibronectin，hFN)檢測(cè)EPCs的黏附能力；用體外血管生成分析試劑盒檢測(cè)不同濃度AGEs-HSA作用后的EPCs成血管

6、能力；分別采用甲醛和Dnase I誘導(dǎo)EPCs凋亡作為陽性對(duì)照組，用Annexin V-FITC/PI和TUNEL法流式細(xì)胞儀檢測(cè)AGEs對(duì)EPCs凋亡率的影響。 結(jié)果： 1．經(jīng)高濃度AGEs-HSA作用的EPCs的梭形變能力明顯變差。 2．以不同濃度AGEs-HSA作用EPCs 2天，可見AGEs-HSA高濃度組EPCs貼壁細(xì)胞顯著減少。 3．貼壁EPCs經(jīng)AGEs-HSA作用后，可見已貼壁細(xì)胞懸浮于培

7、養(yǎng)基中，并隨AGEs-HSA濃度的增加而增多；EPCs的黏附、增殖、遷移能力在AGEs-HSA高濃度組均明顯減弱。 4．EPCs的早期凋亡在AGEs-HSA高濃度各組增多，各組間細(xì)胞凋亡數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中晚期凋亡檢測(cè)未見細(xì)胞凋亡隨AGEs-HSA濃度增加而增多，各組間細(xì)胞凋亡無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1．AGEs-HSA可抑制EPCs的分化、成熟，且抑制程度與AGEs-HSA濃度正相關(guān)。 2．AGEs-HS