pAd-PPARγ重組腺病毒載體的構建及鑒定.pdf

1、目的:
　　構建針對PPARγ基因的重組腺病毒載體 pAdEasy-1-PPARγ-pShuttle-CMV(簡寫pAd-PPARγ)并對其進行包裝,擴增,純化及滴度檢測,為PPARγ參與血管內(nèi)皮胰島素抵抗的調(diào)控研究奠定基礎。
　　方法:
　?、貶UVECs細胞中提總RNA;
　?、谟萌浇鹉孓D錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA;
　?、跴CR擴增目的片段PPARγ;
　?、軜嫿ㄖ亟M穿梭質粒PPARγ-

2、pShuttle-CMV;
　　⑤將重組穿梭質粒PPARγ-pShuttle-CMV與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1在菌株BJ5183中同源重組;
　?、拗亟M腺病毒載體pAdEasy-1-PPARγ-pShuttle-CMV(pAd-PPARγ)的包裝、擴增、純化及病毒滴度檢測;
　?、遬Ad- PPARγ感染HUVECs后PPARγ表達檢測
　　結果:
　?、?PCR結果:從HUVECs細胞中提取總RN

3、A,經(jīng)RT-PCR擴增,在1％的瓊脂糖凝膠電泳后在1433bp附近處有亮帶,說明成功擴增出PPARγ DNA目的片段;
　?、谥亟M穿梭質粒PPARγ-pShuttle-CMV酶切鑒定結果:將重組穿梭質粒PPARγ-pShuttle-CMV經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后電泳應在約7500bp位置和約1400bp位置各有一條亮帶;
　　③重組穿梭質粒PPARγ-pShuttle-CMV測序鑒定結果:經(jīng)測序鑒定,以pShuttle-

4、CMV質粒通用引物為測序引物,共測約1400個堿基,經(jīng)比對與GenBank上公布的序列一致;
　?、苤亟M腺病毒載體pAd-PPARγ酶切鑒定:將重組的穿梭質粒PPARγ-pShuttle-CMV與含有腺病毒骨架質粒的pAdEasy-1在BJ5183感受態(tài)細胞中進行同源重組,經(jīng)PacⅠ單酶切后電泳條帶應在約30Kb和4.5Kb附近有兩條帶,說明重組成功;
　?、葜亟M腺病毒載體pAd-PPARγ包裝與擴增:經(jīng)PacⅠ限制性內(nèi)切酶

5、單切pAd-PPARγ,通過脂質體轉染法轉染至HEK293細胞中進行包裝與擴增,得到一定滴度的病毒液,病毒包裝成功后,細胞出現(xiàn)病變現(xiàn)象,細胞變圓脫落,出現(xiàn)細胞病變效應(CPE),說明病毒包裝基本完成;
　?、拗亟M腺病毒載體pAd-PPARγ病毒滴度檢測結果:經(jīng)擴增純化,采用TCID50方法檢測,其TCID50為10-6.7/mL,達到感染真核細胞標準,病毒滴度較滿意;
　?、遬Ad-PPARγ感染HUVECs后PPARγ表達