Ⅰ群禽腺病毒的分離鑒定和生物學(xué)特性研究及重組禽腺病毒的構(gòu)建.pdf

1、腺病毒最早發(fā)現(xiàn)于1953年，由于它們傾向于感染上皮細(xì)胞而被命名為腺病毒。腺病毒屬腺病毒科(Adenoviridae)，共分為四個(gè)屬即哺乳動(dòng)物腺病毒屬(Mastadenovirus)、禽腺病毒屬(Aviadenovirus)、腺胸腺病毒屬(Atadenovirus)和唾液腺病毒屬(Siadenovirus)。禽腺病毒是禽類常見(jiàn)的病毒之一，大部分在禽體內(nèi)復(fù)制卻不致病，少數(shù)引起輕微的病癥。對(duì)禽腺病毒的流行和變異國(guó)外有很多研究工作，國(guó)內(nèi)的報(bào)道較

2、少。 腺病毒作為載體，宿主范圍廣，致病性低，在機(jī)體內(nèi)復(fù)制不發(fā)生整合，安全性高；能方便，載體疫苗可經(jīng)口服途徑接種。因此以腺病毒作為病毒載體具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。許多學(xué)者在禽類腺病毒載體方面做了很多研究工作，國(guó)內(nèi)研究較晚，但是所研制的基因工程疫苗離臨床應(yīng)用還有一定距離。目前，對(duì)禽腺病毒載體研究主要使用CMV啟動(dòng)子，獲得了較好的表達(dá)效果，也有使用病毒自身的晚期啟動(dòng)子／先導(dǎo)序列(MLP／LS)的報(bào)道，但是尚未見(jiàn)到對(duì)兩個(gè)啟動(dòng)子的重組病毒的免疫效

3、果進(jìn)行比較的報(bào)道。 本研究從外表健康禽群中隨機(jī)采取泄殖腔拭子，根據(jù)禽腺病毒CELOV的全序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增了病毒基因組右末端1.5Kbp的ITR片段。結(jié)果表明：禽腺病毒在禽群中的流行比較廣泛，雞群的陽(yáng)性率為23.8％(30／1.26)，鴨群的陽(yáng)性率為51.7％(15／29)，鵝群的陽(yáng)性率為17.3％(10／58)。從雞源、鴨源、鵝源ITR擴(kuò)增陽(yáng)性的樣品中各選取3株，將ITR片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序，并與CELOV、FA

4、V-9、EDSV以及FAV-JS株的相應(yīng)序列進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：本次分離的9株禽腺病毒與血清l型的代表株CELOV和我們實(shí)驗(yàn)室早期分離株FAV-JS株在ITR片段上的同源性最高可達(dá)99.9％，最低也為94.7％：而與D亞群的FAV-9和禽腺病毒Ⅲ群的EDSV相比較，同源性較低。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的CELOV的全基因組序列設(shè)計(jì)了引物，對(duì)分離株的保守序列ORF8進(jìn)行了擴(kuò)增和序列測(cè)定工作，結(jié)果表明所有分離株、CELOV、FAV-9、E

5、DSV以及FAV-JS株的ORF8片段均具有高度同源性，符合腺病毒的基因組結(jié)構(gòu)特征。根據(jù)以上序列分析結(jié)果，本研究證明了這些分離到的禽腺病毒屬于Ⅰ群禽腺病毒。同時(shí)，禽腺病毒在雞群、鴨群、鵝群中非常普遍，有必要對(duì)這些病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。 為了更好的了解分離株的生物學(xué)特性以便探討其作為活病毒疫苗載體的可能性，通過(guò)病毒凝集實(shí)驗(yàn)、電鏡形態(tài)觀察、細(xì)胞病變、動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)等方法對(duì)上述疑為I群禽腺病毒3個(gè)分離株進(jìn)行了研究。電鏡觀察病毒粒子，

6、結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒為球型、無(wú)囊膜，直徑為70-80nm，具有腺病毒典型的二十面體結(jié)構(gòu)。紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)證明，分離到的病毒均不能凝集雞的紅細(xì)胞，與Ⅰ群禽腺病毒的特征一致。細(xì)胞培養(yǎng)表明：病毒分離株不能引起雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)的細(xì)胞病變，而在雞胚腎細(xì)胞(CEK)上可以產(chǎn)生典型的禽腺病毒的細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，折光性增強(qiáng)等病變。雞胚接種試驗(yàn)未見(jiàn)明顯肉眼可見(jiàn)的病變，雞胚生長(zhǎng)發(fā)育正常，這與Ⅰ群禽腺病毒分離株CELOV的特性不完全一致。 通過(guò)

7、大劑量皮下注射和口服兩種途徑接種1日齡的SPF雞，進(jìn)行人工致病性試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)雞在感染病毒后，未出現(xiàn)任何明顯臨床癥狀。在10日齡時(shí)，皮下注射和口服攻毒的小雞的體重都明顯輕于對(duì)照組，而在20、30日齡時(shí)，各組和健康對(duì)照組之間體重沒(méi)有明顯差異，表明該分離株對(duì)SPF雞的體重影響不大，呈一過(guò)性。在10日齡時(shí)，攻毒組小雞主要免疫器官重量略低于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)后期各組免疫免疫器官的重量基本一致。組織病理學(xué)切片觀察結(jié)果表明，部分臟器有輕微病變，大部

8、分臟器基本沒(méi)有病變，后期組織器官均正常。這表明該病毒對(duì)免疫器官?zèng)]有明顯的生長(zhǎng)抑制和可見(jiàn)的病理?yè)p傷。以上體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明病毒分離株致病性低，生物安全性高，可能是較好的禽腺病毒載體。 前期研究中篩選了FAV-JS的復(fù)制非必需區(qū)，將CMV調(diào)控外源基因表達(dá)的表達(dá)盒插入的禽腺病毒FAV-JS株左右臂構(gòu)建了通用轉(zhuǎn)移載體pFACMV3.1。在此研究基礎(chǔ)上，從本實(shí)驗(yàn)室分離的所有禽腺病毒中選擇FAV-JS進(jìn)行重組禽腺病毒的構(gòu)建。本研究根據(jù)CELO

9、V全基因序列設(shè)計(jì)引物，從FAVI-JS基因組中PCR擴(kuò)增出腺病毒的主要晚期啟動(dòng)子(MLP)，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序，并與CELOV的MLP進(jìn)行了序列比較，兩者同源性為99％。在此基礎(chǔ)上，將FAVI-JS株MLP片段克隆至pcDNA3.1／zeo(+)，然后再將pFACMV3.1中含有部分L片段和完整R片段的L＃-R片段克隆至同一pcDNA3.1／zeo(+)中，隨后將含有MLP片段、部分L片段和完整R片段的大片段克隆至pFACMV3.1，將

10、pFACMV3.1中的CMV啟動(dòng)子替換為MLP啟動(dòng)子，而其它部分不變，從而構(gòu)建了MLP啟動(dòng)子控制的通用轉(zhuǎn)移載體pFAMLP 3.1。在此基礎(chǔ)上插入eGFP報(bào)告基因，構(gòu)建了MLP啟動(dòng)子控制表達(dá)eGFP的正向轉(zhuǎn)移載體pFAMLP-eGFP，以用于重組病毒的構(gòu)建。將構(gòu)建的pFAMLP-eGFP轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染原代雞胚腎細(xì)胞(CEK)細(xì)胞，證實(shí)所克隆的MLP啟動(dòng)子具有啟動(dòng)子活性。在此研究基礎(chǔ)上，將pFAMLP-eGFP轉(zhuǎn)染已被wtFAVI-JS分離