蘋果CAX基因家族生物信息學(xué)分析及sMdCAX1基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、蘋果(Malus domestica Borkh.)是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)果樹之一，近年來(lái)隨著環(huán)境污染以及土壤重金屬化不斷加重，使得蘋果Ca2+流失增加，生理代謝紊亂，產(chǎn)量和品質(zhì)不同程度的降低。鈣反向轉(zhuǎn)運(yùn)體(Ca2+/H+ antiporters，CAXs)是一類重要的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是調(diào)節(jié)胞內(nèi)外Ca2+平衡重要的外向轉(zhuǎn)運(yùn)體，在植物營(yíng)養(yǎng)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)上起著非常關(guān)鍵的作用。目前很多CAXs基因已經(jīng)被克隆，且在模式植物中得以轉(zhuǎn)化，但在木本植物中研究的很

2、少。為提高蘋果對(duì)Ca2+的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)以及提高抗逆性，本實(shí)驗(yàn)在前人的研究基礎(chǔ)上，搜索蘋果全基因組，鑒定蘋果CAXs基因家族成員，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，然后從蘋果cDNA中克隆MdCAX1基因全長(zhǎng)，構(gòu)建了sMdCAX1基因的植物雙元表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法導(dǎo)入‘長(zhǎng)富6號(hào)’中，獲得轉(zhuǎn)基因植物。主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用生物信息學(xué)的方法對(duì)蘋果MdCAXs基因家族進(jìn)行染色體定位、等電點(diǎn)、親疏水性、跨膜區(qū)域、亞細(xì)胞定位及保守結(jié)構(gòu)域

3、進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析，還分析了MdCAXs基因與其他物種CAXs基因的進(jìn)化關(guān)系。用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法對(duì)蘋果MdCAXs基因在不同鹽處理下根、莖、葉中的表達(dá)變化進(jìn)行分析。結(jié)果表明，蘋果MdCAXs家族包含8個(gè)成員，分別屬于CAXsⅠ型中的A亞型和B亞型，編碼的氨基酸在436～817個(gè)氨基酸之間，等電點(diǎn)在4.97～7.12之間，且都為疏水性蛋白;所有MdCAXs基因編碼的氨基酸都有11個(gè)及以上的跨膜區(qū)域，含有CAX基因5個(gè)典型的功能域:

4、N-端自抑制區(qū)域（NRR）、C-端功能區(qū)域、Ca2+功能域(CaD)、C功能域和D功能域。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)MdCAXs主要是定位在質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。蘋果MdCAXs基因具有組織特異性表達(dá)特點(diǎn)，不同的鹽處理根、莖、葉中表達(dá)發(fā)生不同程度的變化，反映了MdCAX存在功能上的差異，對(duì)不同陽(yáng)離子有特異性的應(yīng)答反應(yīng)。
　　2.根據(jù)NCBI登陸的MdCAX1基因序列設(shè)計(jì)引物，從蘋果葉片中克隆MdCAX1基因的ORF框，以克隆的ORF框?yàn)槟０婵寺?/p>

5、編碼去除N末端序列的sMdCAX1基因，獲得一段大小為1272 bp的片段。通過(guò)對(duì)MdCAX1基因ORF框酶切位點(diǎn)的分析，發(fā)現(xiàn)序列中在第413 bp和658 bp處有兩個(gè)SacⅠ位點(diǎn)，利用重疊PCR的方法以sMdCAX1基因?yàn)槟０?，將序列中的SacⅠ位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得大小為1272 bp的突變序列sORF1+2Mu。同時(shí)構(gòu)建pYH4215-sMd1植物雙元表達(dá)載體，將該表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中。
　　3.以‘長(zhǎng)富6