桑樹DREB基因家族生物信息學(xué)分析及功能研究.pdf

1、自然條件下，植物在整個(gè)生命周期中經(jīng)常遇到多種脅迫，其中干旱、高溫、低溫和高鹽等非生物脅迫是影響和限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要因子，甚至?xí)?dǎo)致植物的死亡，從而嚴(yán)重影響農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)效益。因此，非生物脅迫響應(yīng)的相關(guān)基因研究具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　 轉(zhuǎn)錄因子作為基因上游的調(diào)控因子，在植物的抗逆性方面起著重要作用，其可以激活多種脅迫相關(guān)的調(diào)控及功能基因的表達(dá)，在提高植物抗逆性方面比單一的功能基因更為有效。目前，植物中研究的比較多的逆境相關(guān)的

2、轉(zhuǎn)錄因子主要有MYB、WRKY、bZIP、AP2/ERF和NAC五大類。AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子作為與脅迫相關(guān)的一大類轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)又分為AP2、ERF、DREB、RAV和其他等五個(gè)亞家族，其中DREB(Dehydrationresponsiveelementbinding)類轉(zhuǎn)錄因子是AP2/ERF家族中與干旱、高溫、低溫等逆境脅迫相關(guān)的植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其可以特異的與DRE(Dehydrationrespossive

3、element)元件相結(jié)合，調(diào)控啟動(dòng)子中含有DRE元件的基因的表達(dá)，能整體性的提高植物的抗逆性，因此，DREB類轉(zhuǎn)錄因子的研究受到廣泛的關(guān)注。但是，目前關(guān)于DREB類轉(zhuǎn)錄因子的研究主要集中在草本植物中，而在木本植物的研究鮮有報(bào)導(dǎo)。
　　 桑樹(MorusL.)屬多年生雙子葉木本植物，從南緯10°到北緯50°都有分布。我國(guó)是世界桑樹的主要起源地，是世界上桑種質(zhì)資源最多的國(guó)家。桑樹對(duì)脆弱環(huán)境的抗逆性極強(qiáng)，具有耐澇、耐干旱、耐貧瘠、發(fā)

4、根力強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，且桑葉對(duì)二氧化硫、氟化氫、氯氣等污染物有很強(qiáng)的耐受性和吸收凈化能力，是一種優(yōu)良的生態(tài)經(jīng)濟(jì)樹種。但是，目前關(guān)于桑樹抗逆性方面的研究并不多見，關(guān)于桑樹DREB轉(zhuǎn)錄因子的研究更是未見報(bào)道，因此，對(duì)桑樹中DREB類轉(zhuǎn)錄因子的研究將有助于補(bǔ)充完善DREB類轉(zhuǎn)錄因子在木本植物研究的不足，進(jìn)一步探究和完善DREB類轉(zhuǎn)錄因子的逆境調(diào)控機(jī)理。本研究通過生物信息學(xué)的方法對(duì)川?；蚪M數(shù)據(jù)中的30條DREB蛋白序列進(jìn)行序列分析、克隆，并

5、以湖桑為材料對(duì)其中的20個(gè)基因進(jìn)行了高溫、低溫、干旱和高鹽脅迫四種脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析，對(duì)響應(yīng)干旱和高鹽的基因MnDREB4G進(jìn)行克隆，構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到擬南芥中進(jìn)行功能研究。本研究的主要結(jié)果如下:
　　 1.川桑DREB基因家族生物信息學(xué)分析
　　 采用生物信息學(xué)分析方法，從川桑數(shù)據(jù)庫中分析得到110個(gè)含有AP2結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，其中AP2家族17個(gè)，RAV家族3個(gè)，ERF家族54個(gè)，DREB家族30個(gè)，其他類6個(gè)。根據(jù)

6、AP2保守結(jié)構(gòu)域的序列特征，川桑DREB家族又分為6個(gè)組，其中A1-A6組所含基因個(gè)數(shù)為2、5、2、8、8、5，其各個(gè)組基因的分布情況與擬南芥相類似。其蛋白的分子量多在20-30KD，等電點(diǎn)在4.78到8.93之間?；蜷L(zhǎng)度多在1000bp以下，并且除了第二組的MnDREB2B，MnDREB2C，和MnDREB2E為多外顯子基因外，其他27個(gè)基因均為單外顯子，這一情況與水稻中的第二組的基因結(jié)構(gòu)存在類似情況，推測(cè)川桑第二組的這三個(gè)基因也可

7、能存在選擇性剪切機(jī)制。對(duì)上游啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)，川桑DREB基因上游的啟動(dòng)子序列中含有多種脅迫相關(guān)的元件。由轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，30個(gè)DREB基因中的27個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄組中存在表達(dá)數(shù)據(jù)，各個(gè)組內(nèi)的基因間表達(dá)模式不盡相同，如第六組的MnDREB6B在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中表達(dá)量最高，但是MnDREB6E在各個(gè)組織中卻很低。
　　 2.桑樹DREB基因脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析
　　 以川桑DREB基因序列為依據(jù)設(shè)計(jì)RT-PCR引物，從湖桑cDN

8、A中篩選得到20對(duì)可用引物，對(duì)篩選得到的對(duì)應(yīng)的20個(gè)基因進(jìn)行高溫、低溫、干旱、高鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)不同組基因?qū)Σ煌{迫具有不同的響應(yīng)，且與其上游啟動(dòng)子序列中含有的脅迫元件不存在必然的關(guān)系。推測(cè)川桑中由DREB轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)機(jī)制可能更為復(fù)雜，需要多個(gè)基因的相互作用，也可能是川桑中的啟動(dòng)子序列與湖桑中對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子序列存在差異，以湖桑為材料進(jìn)行的脅迫處理結(jié)果不能完全代表川桑中相應(yīng)基因?qū)γ{迫的響應(yīng)機(jī)制。
　　 3.MnD

9、REB4G的功能研究
　　 成功構(gòu)建MnDREB4G轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，對(duì)14號(hào)、29號(hào)、32號(hào)轉(zhuǎn)基因株系中的脅迫相關(guān)的下游基因rd17、LEA14和rd29A的表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，rd17和rd29A基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量上調(diào)，且和目的基因MnDREB4G的表達(dá)模式相一致，表明MnDREB4G基因?qū)d17和rd29A的表達(dá)起到促進(jìn)作用，且促進(jìn)作用與MnDREB4G基因的表達(dá)量成正相關(guān);而LEA14基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南