惡性骨腫瘤側(cè)群(SP)細(xì)胞的分離,鑒定及生物學(xué)特性研究.pdf

1、惡性骨腫瘤起源于中外胚層的間葉組織，在臨床上總體發(fā)病率不高，但大都具有高度惡性，容易發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差。近年來雖然手術(shù)方式及化療藥物在不斷改善，但收效甚微。造成這種現(xiàn)象最主要的原因是惡性骨腫瘤患者對(duì)目前的治療（主要是化療）不敏感。目前有關(guān)惡性骨腫瘤抗藥性和復(fù)發(fā)的調(diào)控機(jī)制我們還知之甚少，有人認(rèn)為導(dǎo)致治療失敗的原因是惡性骨腫瘤中可能存在一小部分細(xì)胞具有某些干細(xì)胞特征（自我更新，高抗藥性，高侵襲性），從而最終導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。這個(gè)

2、觀點(diǎn)恰好與目前腫瘤研究領(lǐng)域中最前沿的腫瘤干細(xì)胞(cancerstemcell,CSC)理論相符合。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤中存在一小部分具有高抗藥性的細(xì)胞，這些細(xì)胞與正常成體干細(xì)胞一樣具有自我更新能力，能產(chǎn)生不同類型的后裔細(xì)胞以構(gòu)成腫瘤組織。該理論可以很好的解釋目前治療中腫瘤抗藥性和復(fù)發(fā)的原因，靶向治療腫瘤干細(xì)胞已引起人們極大地興趣。
　　盡管在很多類型的腫瘤中都已證實(shí)存在腫瘤干細(xì)胞，但有關(guān)惡性骨腫瘤的腫瘤干細(xì)胞研究卻鮮有報(bào)道。這可

3、能是到因?yàn)槟壳盀橹惯€沒有公認(rèn)的惡性骨腫瘤特異性表面標(biāo)志。不過干細(xì)胞的另一種特性（高效外排DNA染料Hoechst33342）也可以用來分離具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞，采用此方法可以分離出一小部分側(cè)群（sidepopulation，SP）細(xì)胞?，F(xiàn)已在多種類型的腫瘤組織和細(xì)胞系中分離出SP細(xì)胞，并證實(shí)SP細(xì)胞具有許多與干細(xì)胞相似的特征，這些都提示SP細(xì)胞中富含腫瘤干細(xì)胞，但有關(guān)惡性骨腫瘤SP細(xì)胞研究卻很少有報(bào)道。
　　因此，我們選擇了人惡性

4、骨腫瘤中具有代表性的骨肉瘤和尤文氏肉瘤作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別從細(xì)胞系和原代腫瘤組織中分離SP細(xì)胞并鑒定其各項(xiàng)生物學(xué)特性，希望可以證實(shí)惡性骨腫瘤SP細(xì)胞具有干細(xì)胞特征。
　　(一)骨肉瘤和尤文氏肉瘤SP細(xì)胞的分離
　　我們成功的在人尤文氏肉瘤細(xì)胞系SK-ES-1中找到并分離出SP細(xì)胞，SP細(xì)胞所占比例為約1.2％。而在人骨肉瘤細(xì)胞系MG63中無法找到SP細(xì)胞；但我們?cè)诠侨饬雠R床標(biāo)本中證實(shí)存在SP細(xì)胞，總共我們分析了6例標(biāo)本，其中5

5、例都發(fā)現(xiàn)存在SP細(xì)胞（OS1-OS5），SP細(xì)胞比例從3.7％到10.2％。
　　(二)SP細(xì)胞與non-SP細(xì)胞各種生物學(xué)特性差異研究
　　1.再生細(xì)胞群能力
　　在體外SK-ES-1的SP細(xì)胞可以同時(shí)生成SP和non-SP細(xì)胞，而non-SP細(xì)胞只能分裂產(chǎn)生non-SP細(xì)胞；OS1-OS5的SP細(xì)胞在體內(nèi)和體外都可以同時(shí)生成SP和non-SP細(xì)胞，但non-SP細(xì)胞在體內(nèi)和體外生成大量non-SP細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生

6、數(shù)量很少的SP細(xì)胞。
　　2.生長(zhǎng)曲線
　　SK-ES-1的SP細(xì)胞群的生長(zhǎng)曲線與non-SP細(xì)胞群的生長(zhǎng)曲線在形狀上相似，二者都有對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。并且SP細(xì)胞群和non-SP細(xì)胞群的分裂增殖速度并沒有明顯的差別；OS1-OS5的SP和non-SP細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線在形狀上與正常細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線類似，都具有對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，但前3-4天non-SP細(xì)胞生長(zhǎng)速度似乎要快于SP細(xì)胞。
　　3.體外克隆形成能力和侵襲性
　　SK-ES

7、-1和OS1-OS5的SP細(xì)胞都表現(xiàn)出明顯高于non-SP細(xì)胞的體外克隆形成能力，而non-SP細(xì)胞與未經(jīng)Hoechst33342染色的原始細(xì)胞的體外克隆形成能力沒有顯著的差別；同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)體外SK-ES-1SP細(xì)胞比non-SP細(xì)胞更具侵襲性。
　　4.裸鼠體內(nèi)成瘤能力
　　OS1和OS5的SP細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)表現(xiàn)出高致瘤性，同時(shí)non-SP細(xì)胞也表現(xiàn)出一定的致瘤性；但只有SP細(xì)胞具有自我更新能力：在連續(xù)移植實(shí)驗(yàn)中只有SP

8、細(xì)胞能保持致瘤性，non-SP細(xì)胞無法成瘤，并且SP細(xì)胞的第二次異種移植瘤與原代腫瘤以及第一次異種移植瘤都具有相同的組織病理學(xué)細(xì)胞形態(tài)。
　　5.抗藥性
　　化療藥物阿霉素（doxorubicin）和順鉑（cisplatin）對(duì)SK-ES-1SP細(xì)胞的IC50明顯高于對(duì)non-SP細(xì)胞的IC50；阿霉素（doxorubicin），順鉑（cisplatin）和甲氨蝶呤（methotrexate）對(duì)OS1，OS2和OS5SP細(xì)胞

9、的IC50明顯高于對(duì)non-SP細(xì)胞的IC50（除OS1順鉑組，OS5順鉑和甲氨蝶呤組）。這些都提示SP細(xì)胞比non-SP細(xì)胞具有更高的化療藥物提抗性。
　　6.“干”性基因表達(dá)
　　通過RT-PCR分析我們發(fā)現(xiàn)SK-ES-1和OS1-OS5的SP細(xì)胞中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族基因表達(dá)上調(diào)，尤其是ABCG2，在所有檢測(cè)的SP細(xì)胞中全部高表達(dá)；此外，Oct-4和Nanog在OS1-OS5的SP細(xì)胞中表達(dá)也上調(diào)。
　　綜上所述，我們