犬細小病毒的分離鑒定與生物學特性研究.pdf

1、犬細小病毒病在1978年成為全球性疾病,并且從那以后在世界各地呈地方性流行(Parrish,1990；Truyen,1995)。本研究旨在獲得華中地區(qū)的犬細小病毒分離株并對其基因型分型、流行病學、生物學特性及致病力進行探討。
　　 從武漢部分寵物醫(yī)院采集膠體金初檢陽性的50份可疑病料,用貓腎細胞(F81)進行病毒分離,并進行電鏡觀察。根據犬細小病毒2型(CPV-2)保守的VP2,設計一對引物,用來鑒定CPV；參考文獻(kapil

2、 et al.,2007)合成另一對引物,用來調查犬細小病毒的不同基因型的流行狀況；參考CPV全序列設計擴增VP2全長的引物,并進行遺傳進化分析。為了得到分離株的閱讀框(ORF),又設計了四對引物。在細胞上對最先分離到的5株病毒進行空斑純化,進行一步法生長曲線測定。最后對這5株病毒都進行動物回歸實驗。
　　 細胞傳代結果表明,從50份病料中獲得了34株犬細小病毒。PCR擴增結果表明獲得390bp、583bp和1755bp三個片段

3、。與Genbank發(fā)布的CPV-2比對后,390bp的測序結果表明我們獲得的28株病毒是犬細小病毒而583bp測序的結果表明所獲得的28株病毒中,有30株屬于2a型,4株屬于2b型。對VP2全序列進行的遺傳進化分析表明,我們得到的分離株與最早分離的毒株距離最遠,與歐洲、美洲的毒株距離較遠,與中國分離株較近?？瞻呒兓吧L曲線繪制結果表明分離毒株增殖滴度可達105.5PFU/mL。通過比較同步接毒和非同步接毒所繪制的生長曲線發(fā)現(xiàn),在接毒的

4、前12小時內略微有點區(qū)別,細胞傳代8小時后進行接毒的生長曲線一開始有下降趨勢,接著又慢慢開始上升,而同步接毒的生長曲線從一開始接毒就是上升趨勢。在一定條件下都可以凝集豬的紅細胞,并且該凝集可以被犬細小病毒單克隆抗體特異性阻斷。電鏡觀察結果表明,感染細胞的線粒體腫脹。通過PCR,我們得到了毒株3和毒株10的完整的ORFs。動物回歸試驗結果表明犬只都能表現(xiàn)不同程度的發(fā)病狀況,如嘔吐、排血便等。在細胞上檢測,發(fā)現(xiàn)有排毒現(xiàn)象,最高排毒量可達10