鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的分離、鑒定以及生物學(xué)特性研究.pdf

1、研究背景：
　　 鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)是東南亞地區(qū)包括我國南部省份常見的惡性腫瘤之一。本研究首先以鼻咽癌CNE2細(xì)胞系為研究對象，利用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測多種常見腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物在其中的表達(dá)，初步確定鼻咽癌干細(xì)胞的候選特異性表面標(biāo)記。經(jīng)免疫磁珠分選后，進(jìn)一步選擇3種調(diào)控干細(xì)胞多能性及自我更新的轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、Nanog和Sox2作為檢測指標(biāo)，應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光顯色技術(shù)，檢測目標(biāo)細(xì)胞

2、中3種抗體共表達(dá)的情況。探討鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞存在的可能。其次，在獲得了表達(dá)特異性抗原細(xì)胞的基礎(chǔ)上，通過一系列試驗(yàn)，從細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖活性以及體外體內(nèi)成瘤能力方面，鑒定該亞群細(xì)胞是否具備強(qiáng)大的自我更新和分化潛力，是否擁有高成瘤性。初步闡明鼻咽癌干細(xì)胞相關(guān)亞群的生物學(xué)行為特征，為進(jìn)一步探索其分子調(diào)控機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。最后，為了更接近于人體內(nèi)腫瘤的生物學(xué)特性，我們立足于鼻咽癌原代細(xì)胞的培養(yǎng)，通過一系列體內(nèi)、體外試驗(yàn)探討相同的

3、特異性標(biāo)記物在原代細(xì)胞中的表達(dá)情況。鑒定其分選后的亞群細(xì)胞是否同樣具備腫瘤干細(xì)胞的特征。明確鼻咽癌原代細(xì)胞模型和已建系的細(xì)胞株模型在研究腫瘤干細(xì)胞中的異同。為今后進(jìn)一步創(chuàng)造更接近于人體內(nèi)腫瘤生長微環(huán)境的試驗(yàn)?zāi)Ｐ吞峁├碚撘罁?jù)。
　　 一、人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志的探討
　　 目的：初步確定鼻咽癌干細(xì)胞的候選特異性細(xì)胞表面標(biāo)記物。
　　 方法：以人鼻咽癌CNE2細(xì)胞系為研究對象，利用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測候選

4、干細(xì)胞標(biāo)志CD34、CD44、CD133在細(xì)胞膜中的表達(dá)。初步選擇CD133作為鼻咽癌干細(xì)胞的候選特異性標(biāo)記進(jìn)行分選。經(jīng)免疫磁珠法分選后，應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光顯色技術(shù)，檢測CD133+及CD133-亞群細(xì)胞中Oct3/4、Sox2和Nanog3種抗體共表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：1、鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞中膜抗原CD133呈低度穩(wěn)定表達(dá)，表達(dá)率為3.36％±0.35％；CD44則大量表達(dá)，表達(dá)率為82.79％±0.99％；CD34表達(dá)

5、較多，表達(dá)率為11.76％±1.22％。
　　 2、免疫熒光細(xì)胞染色顯示CD133+細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)2個(gè)調(diào)控干細(xì)胞多能性的標(biāo)記物Nanog和Sox2。不表達(dá)Oct3/4。
　　 3、免疫磁珠分選效率穩(wěn)定可靠，分選效率平均為89.15％±7.80％。
　　 結(jié)論：1、CD133可以作為鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的候選特異性表面標(biāo)記物。
　　 2、免疫磁珠分選技術(shù)是分離提純鼻咽癌細(xì)胞株中CD133+細(xì)胞亞群的有效方法。<

6、br>　　 二、鼻咽癌細(xì)胞系CNE2中CD133+細(xì)胞的生物學(xué)特性初探
　　 目的：探討鼻咽癌細(xì)胞系CNE2細(xì)胞中CD133+及CD133-亞群細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特征和體內(nèi)成瘤能力
　　 方法：以人鼻咽癌CNE2細(xì)胞系為研究對象，首先用免疫磁珠分選法得到CD133+細(xì)胞及CD133-細(xì)胞，隨后通過MTT比色法測定兩亞群細(xì)胞的增殖能力，繪制生長曲線；平板克隆形成試驗(yàn)比較兩亞群細(xì)胞的體外克隆形成能力；應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定細(xì)

7、胞周期的分布特點(diǎn)并計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)；應(yīng)用流式細(xì)胞儀動態(tài)監(jiān)測分選純化后的CD133+細(xì)胞在體外培養(yǎng)中CD133抗原表達(dá)的變化情況；通過無血清懸浮培養(yǎng)檢測兩亞群細(xì)胞的克隆球形成能力；通過裸鼠成瘤試驗(yàn)，檢驗(yàn)兩亞群不同數(shù)量的細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤能力；HE染色檢驗(yàn)種植瘤的病理組織類型；原代培養(yǎng)種植瘤的腫瘤細(xì)胞，并使用流式細(xì)胞儀檢測移植瘤細(xì)胞中CD133表面抗原的表達(dá)。
　　 結(jié)果：1、兩亞群細(xì)胞的生長曲線、體外克隆試驗(yàn)表明， CD133+細(xì)胞

8、的自我更新和增殖成瘤能力明顯大于CD133-細(xì)胞(P＜0.05)
　　 2、在1個(gè)月的觀察期內(nèi)，1×105數(shù)量的CD133+細(xì)胞可以在裸鼠背部成瘤，而CD133-細(xì)胞不能成瘤。
　　 3、兩亞群細(xì)胞的細(xì)胞周期分布特點(diǎn)以及細(xì)胞增殖指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4、分選出的CD133+細(xì)胞在含5％胎牛血清的RPM11640培養(yǎng)基生長，大部分細(xì)胞在增值過程中轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌硇偷募?xì)胞，培養(yǎng)至21天后，僅0.37％±0.10％的細(xì)

9、胞表達(dá)CD133。
　　 5、在無血清培基中，CD133+腫瘤細(xì)胞可以懸浮生長，形成類似腫瘤克隆的細(xì)胞球，而CD133-細(xì)胞則大部分凋亡，僅少數(shù)貼壁緩慢生長。
　　 6、種植瘤組織經(jīng)HE染色檢查證實(shí)為低分化非角化型癌。原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)與CNE2細(xì)胞相似。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，CD133陽性細(xì)胞約占總數(shù)的2.17％±0.46％。
　　 結(jié)論：1、鼻咽癌細(xì)胞株CNE2中，CD133+表型細(xì)胞與CD133-表型細(xì)胞相

10、比，在體外具有更強(qiáng)的自我更新和克隆成瘤能力；膜抗原CD133呈低度穩(wěn)定表達(dá)。
　　 2、鼻咽癌細(xì)胞株CNE2中，CD133+表型細(xì)胞與CD133-表型細(xì)胞相比，在裸鼠體內(nèi)具有更強(qiáng)的成瘤能力。
　　 3、鼻咽癌細(xì)胞株CNE2中，CD133+表型細(xì)胞具有分化為其他表型細(xì)胞的能力。
　　 4、鼻咽癌CNE2細(xì)胞株中，CD133+細(xì)胞亞群的細(xì)胞周期分布特點(diǎn)及細(xì)胞增殖指數(shù)與CD133-細(xì)胞亞群相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。

11、>　　 三、人鼻咽癌原代細(xì)胞培養(yǎng)及腫瘤干細(xì)胞的分選、鑒定
　　 目的：探討鼻咽癌原代細(xì)胞中CD133+及CD133-亞群細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特征和體內(nèi)成瘤能力。比較原代細(xì)胞與細(xì)胞株試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷漠愅c(diǎn)。
　　 方法：應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法得到鼻咽癌原代細(xì)胞后，先用免疫磁珠分選法得到CD133+細(xì)胞及CD133-細(xì)胞，隨后通過用MTT比色法測定兩亞群細(xì)胞的增殖能力，繪制生長曲線；平板克隆形成試驗(yàn)比較兩亞群細(xì)胞的體外克隆形成能力；通

12、過體內(nèi)成瘤試驗(yàn)，檢驗(yàn)兩亞群不同數(shù)量的細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤能力。
　　 結(jié)果：1、人鼻咽癌原代細(xì)胞可以在Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基中增殖生長，經(jīng)角蛋白(CK)熒光染色表明所培養(yǎng)細(xì)胞均為上皮來源。
　　 2、人鼻咽癌原代細(xì)胞培養(yǎng)成活率在40％-60％,各株腫瘤細(xì)胞增殖傳代能力不同。存活期在2代到6代之間。而且生長最旺盛者，表達(dá)CD133表面抗原越多。其中一株表達(dá)CD133表面抗原穩(wěn)定在2.8±0.17％左右。

13、　　 3、兩亞群細(xì)胞的生長曲線、體外克隆試驗(yàn)表明，鼻咽癌原代細(xì)胞中CD133+細(xì)胞的體外增殖成瘤能力大于CD133-細(xì)胞(P＜0.05)。
　　 4、原代培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞分別以1×104及1×105的數(shù)量注入NOD/SCID小鼠(非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷)的皮下，在21-30天的觀察期內(nèi)，CD133+及CD133-亞群的細(xì)胞均未見瘤塊形成。
　　 結(jié)論：1、采用組織塊培養(yǎng)法，應(yīng)用Keratinocyte-SFM

14、培養(yǎng)基，可培養(yǎng)出相對純化的人鼻咽癌原代細(xì)胞。各株細(xì)胞增殖傳代能力不同，生長最旺盛者，表達(dá)CD133表面抗原最多。
　　 2、鼻咽癌原代細(xì)胞中CD133+表型細(xì)胞與CD133-表型細(xì)胞相比，在體外具有更強(qiáng)的自我增殖和克隆成瘤能力。(P＜0.05)
　　 3、鼻咽癌原代細(xì)胞與CNE2細(xì)胞株相比，在腫瘤干細(xì)胞的構(gòu)成比例上有所減少；在相同的條件下，細(xì)胞的自我更新能力、克隆形成能力以及體內(nèi)致瘤能力均有下降。經(jīng)免疫磁珠分選后，鼻咽癌