Survivin、TGFβ3、TIMP-1慢病毒載體轉(zhuǎn)染人髓核細(xì)胞的生物學(xué)作用.pdf

1、目的:構(gòu)建人生存素(Survivin)、轉(zhuǎn)化生長因子β3(TGFβ3)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)三基因過表達(dá)慢病毒載體，通過一次轉(zhuǎn)染，實現(xiàn)Survivin、TGFβ3、TIMP-1三基因在人退變椎間盤髓核細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，通過抑制細(xì)胞凋亡、增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成及抑制其降解，實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)或延緩椎間盤退變的目的。
　　方法:構(gòu)建Survivin、TGFβ3、TIMP-1慢病毒載體，聯(lián)合轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞，應(yīng)用Real-Tim

2、e PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后三基因的過表達(dá)情況，并檢測蛋白多糖和Ⅱ型膠原的mRNA表達(dá)量，應(yīng)用Western blot檢測蛋白多糖和Ⅱ型膠原的蛋白含量，應(yīng)用caspase-3活性檢測試劑盒檢測caspase-3蛋白活性，應(yīng)用AnnexinⅤ-PI雙染色法檢測髓核細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果:人退變髓核細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，Real-Time PCR結(jié)果顯示Survivin、TGFβ3、TIMP-1三基因在基因水平均獲得穩(wěn)定過表達(dá)，且其表達(dá)能維持細(xì)

3、胞傳至P3代或更長時間。目的病毒轉(zhuǎn)染組（A組）較空病毒轉(zhuǎn)染組（B組）、空白對照組（C組），蛋白多糖和Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)量均無明顯差異，Western blot示蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白含量三組無明顯差異，Caspase-3蛋白吸光度及髓核細(xì)胞凋亡率三組亦無明顯差異。
　　結(jié)論:Survivin、TGFβ3、TIMP-1慢病毒載體能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人退變椎間盤髓核細(xì)胞，并且能長時間維持其表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，三基因?qū)υ隗w外培養(yǎng)的髓核細(xì)胞的