人髓核細(xì)胞的生物學(xué)特性研究與組織工程椎間盤的體外構(gòu)建.pdf

1、目的：通過研究不同代次人髓核細(xì)胞的形態(tài)、增殖活性和表型表達(dá)變化，篩選出組織工程椎間盤研究適宜的種子細(xì)胞，并研究轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1)和胰島素樣生長因子-1(insulin-likegrowthfactor1，IGF-1)對髓核細(xì)胞增殖和表型表達(dá)的影響，探討TGF-β1和IGF-1在組織工程椎間盤研究中的應(yīng)用價(jià)值，通過制備聚乳酸—羥基乙酸(PLGA)三維框架，將種子細(xì)胞與框

2、架結(jié)合，體外構(gòu)建組織工程椎間盤。 方法：(1)從人正常和退變髓核組織分離培養(yǎng)髓核細(xì)胞，分別取不同代次細(xì)胞作為研究對象，通過光鏡和電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，對生長曲線、MTT攝取等進(jìn)行測定，RT-PCR方法測定細(xì)胞的聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)，來確定組織工程椎間盤的種子細(xì)胞。(2)將人正常傳2代髓核細(xì)胞作為研究對象，采用MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽)法和RT-PCR技術(shù)，探索TGF-β1和IG

3、F-1對細(xì)胞的形態(tài)、增殖以及Ⅱ型膠原和Aggrecan的調(diào)節(jié)作用，及其時(shí)效與量效的關(guān)系。(3)將人正常髓核細(xì)胞種植于聚乳酸—羥基乙酸(PLGA)三維多孔框架，構(gòu)建了組織工程椎間盤，通過MTT攝取、激光共聚焦熒光顯微鏡及掃描電鏡的方法進(jìn)行體外觀察。 結(jié)果：(1)體外培養(yǎng)條件下，可見退變髓核細(xì)胞排列較紊亂，粗面內(nèi)織網(wǎng)輕度擴(kuò)張。在接種相同的細(xì)胞密度和相同的培養(yǎng)條件下，成人正常和退變髓核細(xì)胞的生長曲線存在差異；二者的MTT攝取在傳1代時(shí)

4、差異均無顯著性(P＞0.05)，傳3、5代時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。不同代次正常髓核細(xì)胞比較，傳3代之前細(xì)胞形態(tài)良好，從傳4代起，部分細(xì)胞向長梭形演化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。生長曲線和MTT試驗(yàn)提示傳3代之前的細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。RT-PCR實(shí)驗(yàn)提示，正常髓核細(xì)胞前3代表達(dá)Ⅱ型膠原和Aggrecan旺盛，從傳4代起開始減少，其中Aggrecan減少更明顯；退變髓核細(xì)胞不僅表達(dá)Ⅱ型膠原和Aggrecan，而且表達(dá)少量Ⅰ型膠原。(2)在1

5、％血清條件下，TGF-β1具有促增殖作用。在10％血清條件下，TGF-β1和IGF-1均能提高細(xì)胞的增殖活性，并且在各自一定的濃度范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系。二者聯(lián)合應(yīng)用作用效果更顯著。10ug/L、100ug/LTGF-β1組和100ug/LIGF-1在促進(jìn)Aggrecan和Ⅱ型膠原基因表達(dá)方面也作用顯著，其中，10ug/L組TGF-β1作用最明顯。(3)細(xì)胞種植于PLGA框架后，行MTT攝取實(shí)驗(yàn)提示細(xì)胞—框架復(fù)合體呈深藍(lán)著色，縱行剖開，可

6、見藍(lán)色晶體均勻分布于整個(gè)材料支架內(nèi)部。激光共聚焦熒光顯微鏡觀察可見大量紅色熒光著色的細(xì)胞貼附于支架結(jié)構(gòu)內(nèi)，掃描電鏡可見大量細(xì)胞貼附于支架內(nèi)，并可見少量細(xì)胞外基質(zhì)分泌。 結(jié)論：(1)本研究提示成人正常髓核細(xì)胞傳代后前3代細(xì)胞形態(tài)良好，增殖能力強(qiáng)，Aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)良好，適合作為組織工程椎間盤的種子細(xì)胞，而退變髓核細(xì)胞由于細(xì)胞活性較低，表型表達(dá)發(fā)生改變，不宜作為種子細(xì)胞。(2)TGF-β1和IGF-1對人正常髓核