酸環(huán)境對(duì)人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)活性的影響.pdf

1、目的:觀察不同程度酸性條件對(duì)成人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞（NPMSCs）生物學(xué)活性的作用，發(fā)掘椎間盤的可能退變機(jī)制。
　　方法：篩選6例脊柱側(cè)凸需矯形手術(shù)患者，留取手術(shù)過程中摘除的6個(gè)PfirrmannⅠ級(jí)或Ⅱ級(jí)腰椎椎間盤，用膠原酶消化髓核組織，分離細(xì)胞，體外培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)。選擇培養(yǎng)的P2代細(xì)胞，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞等表面抗原標(biāo)志物；使用分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)成骨、成軟骨、成脂細(xì)胞，2周后分別染色液對(duì)誘導(dǎo)的細(xì)胞染色，觀察細(xì)胞三系

2、分化能力。參照國際干細(xì)胞治療協(xié)會(huì)（ISCT）給出的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的判定準(zhǔn)則，綜合鑒定分離的細(xì)胞。使用不同pH值的培養(yǎng)基培養(yǎng) P2代細(xì)胞后，用CCK-8法檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞增殖能力，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同pH培養(yǎng)基作用的細(xì)胞凋亡率，使用實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR）檢測(cè)P2代細(xì)胞“干性”基因及酸離子通道家族蛋白基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果：分離的 P0代細(xì)胞均貼培養(yǎng)瓶底壁生長。分離培養(yǎng) P2代細(xì)胞表面抗原檢測(cè)示高表達(dá) CD90

3、、CD105、CD73，三者表達(dá)比例分別達(dá)96％、95％、94%以上，卻低表達(dá) CD45、CD34、HLA-DR（均低于4%）。通過使用特殊染色劑染色結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)中分離得到的細(xì)胞均可向骨、脂肪及軟骨細(xì)胞方向分化。參照 ISCT制定MSCs的判定準(zhǔn)則，認(rèn)為這種細(xì)胞是NPMSCs。 CCK-8檢測(cè)結(jié)果示分離得到的細(xì)胞在不同pH培養(yǎng)液培養(yǎng)后1、3天不同組細(xì)胞吸光度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；5天后各組細(xì)胞吸光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.

4、05），且吸光度隨 pH值降低而減小。凋亡率比較結(jié)果示 pH值7.4組的細(xì)胞凋亡率最小，各組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。RT-PCR檢測(cè)示pH7.4組“干性”基因及酸離子通道蛋白基因最高，高于其余各組（P<0.05），基因表達(dá)量隨著培養(yǎng)液pH值減小而降低。
　　結(jié)論：不同層次的 pH酸環(huán)境條件下培養(yǎng)成人 NPMSCs3天增殖能力未見顯著變化，作用5天后可以看出低pH環(huán)境明顯抑制NPMSCs的增殖能力以及基因表達(dá)，加快細(xì)胞凋亡，而