Apodemus sylvaticus胚胎干細(xì)胞的建系和生物學(xué)特性的研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞來源于胚胎時(shí)期囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，是一種多潛能的干細(xì)胞，能在體外進(jìn)行長(zhǎng)期的自我更新，在體內(nèi)外可以分化為三個(gè)胚層來源的各種細(xì)胞類型，因而在基礎(chǔ)研究和臨床治療中都有很好的應(yīng)用前景。Apodemussylvaticus是一種嚙齒類動(dòng)物，與小鼠在進(jìn)化方面兩者差距比較大，與大鼠和小鼠之間的遺傳差距相近。本研究建立了了Apodemussylvaticus的胚胎干細(xì)胞系，命名為AS-ES1，具有24對(duì)染色體，能在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)傳代中保持未分化狀態(tài)

2、，在體外自然分化能形成胚體，注射于裸鼠皮下能形成畸胎瘤。該細(xì)胞系表達(dá)多種多能性的分子標(biāo)記，包括堿性磷酸酶、Oct-4、Nanog和Rex-1，但是不表達(dá)ssea-1，ssea-3，ssea-4，Tra-1-60和GCTM-2。本研究還成功將GFP和ds-RED兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系，同時(shí)細(xì)胞仍保持增殖和分化潛能，并用RNA干擾技術(shù)滅活上述兩種基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，證明該細(xì)胞系能進(jìn)行基因操作。AS-ES的建立為Apodemussylvatic

3、us發(fā)育和遺傳的研究提供重要的工具，使Apodemussylvaticus有望成為研究基因功能的新的模式動(dòng)物。 本實(shí)驗(yàn)包括兩個(gè)部分：1、Apodemussylvaticus胚胎干細(xì)胞系的建立2、Apodemussylvaticus胚胎干細(xì)胞系的生物學(xué)特性分析第一部分Apodemussylvaticus胚胎干細(xì)胞系的建立材料和方法 1.1動(dòng)物飼養(yǎng)Apodemussylvaticus的飼養(yǎng)條件于小鼠相似，包括飲食、溫度等。

4、 1.2胚胎干細(xì)胞系的建立使用7-9周的Apodemussylvaticus進(jìn)行交配。取受精后3.5天母鼠的子宮，用M2培養(yǎng)液沖洗并收集囊胚，然后接種于預(yù)先接種好的放射后的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞的24孔板中。囊胚在培養(yǎng)1-2天后，胚胎會(huì)從透明帶孵出，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)明顯增殖長(zhǎng)大，繼續(xù)培養(yǎng)3-4天，然后挑取增殖的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)消化吹打成單個(gè)細(xì)胞，接種于新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上。4-7天后即可以觀察到未分化的胚胎干細(xì)胞克隆的生長(zhǎng)。培養(yǎng)條件為37℃

5、，5％CO2和95％濕度。 結(jié)果從受精3.5天的母鼠子宮中獲得5個(gè)囊胚，其中的一個(gè)幾天后長(zhǎng)出大量的類似小鼠胚胎干細(xì)胞的克隆。這些克隆成圓形，邊界清楚。克隆內(nèi)的細(xì)胞排列緊密，核漿比例高，有明顯的核仁，命名為AS-ES1。 白血病抑制因子和飼養(yǎng)層細(xì)胞能夠保持培養(yǎng)細(xì)胞的未分化狀態(tài)，這與小鼠的胚胎干細(xì)胞類似。 結(jié)論成功從嚙齒類動(dòng)物Apodemussylvaticus的囊胚獲得了一種新的胚胎干細(xì)胞系，它能在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)

6、，細(xì)胞形態(tài)特征與小鼠胚胎干細(xì)胞類似。 第二部分Apodemussylvaticus胚胎干細(xì)胞系的生物學(xué)特性分析 材料和方法2.1生長(zhǎng)曲線生長(zhǎng)曲線是評(píng)估細(xì)胞生長(zhǎng)特性的有效工具，從生長(zhǎng)曲線可以確定群體倍增時(shí)間。以0.6×105/ml的密度接種于六孔板，每12小時(shí)消化細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。以E14細(xì)胞株作為對(duì)照。 2.2干細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)為了檢測(cè)該細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，將細(xì)胞固定于4％的多聚甲醛/PBS，用堿性磷酸酶的底物BCI

7、P/NBT進(jìn)行染色。為了進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)的檢測(cè)，用下列一抗進(jìn)行孵育，包括SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60，GCTM-2，orOCT4，然后用FITC標(biāo)記二抗與一抗結(jié)合，最后用DARPI對(duì)樣品進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察。用RT-PCR檢測(cè)各種基因得表達(dá)。首先從胚胎干細(xì)胞提取RNA，用Sensiscript逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)得CDNA，然后用PCR擴(kuò)增目的基因。目的基因和其引物序列如下：Oct4，Nanog，Rex

8、1，陽(yáng)性對(duì)照用GAPDH。 2.3核型分析和性別鑒定染色體的準(zhǔn)備如下：在胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入0.1mg/ml的秋水仙素溫育一個(gè)小時(shí)，然后胰酶消化，用0.075MKCl溶液重懸室溫下放置20分鐘，再在甲醇/乙酸混合液(3∶1)中固定一個(gè)小時(shí)，然后置于玻片上。分散的染色體用1％的姬姆薩染料染色然后拍片，至少要數(shù)20個(gè)出于分裂中期的分散染色體和分析5條G帶的核型。 該細(xì)胞株的性別通過PCR的方法鑒定，目的基因是基因組DNA

9、的Y染色體相關(guān)基因Tspy，陽(yáng)性對(duì)照用X染色體相關(guān)基因PolA1以及Gapdh。 2.4體內(nèi)外分化能力的檢測(cè) 體外分化：胚胎干細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞后接種于不貼壁的培養(yǎng)皿，使用不含白血病抑制因子的培養(yǎng)液，培養(yǎng)兩周后可見大量胚體形成。然后將胚體接種于貼壁的組織培養(yǎng)皿進(jìn)行誘導(dǎo)分化。所得到的分化細(xì)胞用如下幾種抗體進(jìn)行檢測(cè)：內(nèi)胚層albumin，中胚層desmin，外胚層nestin，GFAP和Tuj1，然后用Cy3羊抗鼠的二抗進(jìn)行

10、標(biāo)記。 體內(nèi)分化：為了檢測(cè)其畸胎瘤的形成能力，取1-2x106未分化的胚胎干細(xì)胞注射于4-8周大小的裸鼠皮下，注射后8周取出畸胎瘤用4％的多聚甲醛進(jìn)行固定，常規(guī)石蠟切片和HE染色。 2.5質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染用于轉(zhuǎn)染的兩種質(zhì)粒為pTP6-hrGFP和pTP6-DsRed2，分別表達(dá)綠色和紅色熒光蛋白。兩種質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SCA-1進(jìn)行線性化。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞先用無(wú)抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時(shí)，再加入puromycin(終濃度為2

11、ug/ml)進(jìn)行篩選。篩選7天后挑取抗puromycin的克隆進(jìn)行胰酶消化，然后接種與新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上進(jìn)行培養(yǎng)。 2.6RNA干擾在進(jìn)行RNA干擾時(shí)，先將轉(zhuǎn)染hrGFP的細(xì)胞以較低的密度接種于6孔板中，然后用Lipofectamine2000將雙鏈的siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行GFP基因的干擾，設(shè)立陰性對(duì)照。24小時(shí)后再用Lipofectamine2000進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)染。 結(jié)果2.1生長(zhǎng)曲線所測(cè)得的AS-ES1的群體倍增

12、時(shí)間為12小時(shí)，而E14為17小時(shí)，說明該細(xì)胞的增殖速度更快。 該細(xì)胞已經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)傳代半年(P80)，其細(xì)胞形態(tài)和增殖速度都沒有明顯的改變。 2.2染色體分析和性別鑒定取P24，P63和P80代數(shù)的AS-ES1細(xì)胞進(jìn)行核型分析，結(jié)果為48條染色體為正常核型，表明該細(xì)胞可在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)同時(shí)保持核型的穩(wěn)定。 核型分析觀察到類似Y染色體的存在。設(shè)計(jì)PCR實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增Y染色體相關(guān)基因Tspy，證實(shí)該細(xì)胞含有Y染色體，其核型為

13、48(X，Y)。 2.3干細(xì)胞分子標(biāo)記的表達(dá)絕大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶。檢測(cè)Oct4，SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60和GCTM-2的表達(dá)，只有Oct4為陽(yáng)性。最后，用RT-PCR方法檢測(cè)Oct4，Nanog和Rex1，發(fā)現(xiàn)三種標(biāo)記均為陽(yáng)性。 2.4分化能力體外分化：Apodemussylvaticus胚胎干細(xì)胞在沒有飼養(yǎng)層細(xì)胞和白血病抑制因子的條件下，在不貼壁的培養(yǎng)皿培養(yǎng)時(shí)可見有胚胎體形成。將

14、胚體接種于貼壁的組織培養(yǎng)皿，從胚體生長(zhǎng)出來的細(xì)胞在形態(tài)上有明顯的異質(zhì)性。用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法可以檢測(cè)到三個(gè)胚層來源的細(xì)胞類型。 體外分化：取出畸胎瘤進(jìn)行石蠟切片和HE染色。結(jié)果可見三個(gè)胚層的細(xì)胞類型，如內(nèi)胚層的呼吸道上皮，腺上皮和腸上皮，中胚層的脂肪和肌肉，外胚層的皮膚細(xì)胞和神經(jīng)元。 2.5質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染pTP6-hrGFP和pTP6-DsRed2這兩種質(zhì)粒都帶有puromycin的抗性基因，轉(zhuǎn)染后用puromycin篩

15、選一段時(shí)間，挑取若干能夠穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白的克隆繼續(xù)擴(kuò)增，選取其中的兩個(gè)克隆作進(jìn)一步的分析(AS-ES1-GFP1和AS-ES1-DsRed1)。這兩株細(xì)胞在體外培養(yǎng)傳代(超過15代)仍然保持典型的未分化狀態(tài)，生長(zhǎng)正常而且熒光表達(dá)也沒有減弱，還能產(chǎn)生帶有熒光的胚胎體和畸胎瘤，通過胚層特異分子標(biāo)記檢測(cè)可見存在有三個(gè)胚層的細(xì)胞。 2.6RNA干擾選取能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的AS-ES1-GFP1細(xì)胞株，將特異干擾GFP編碼RNA的si