MIF過表達對宮頸癌細胞株SiHa生物學特性影響的實驗研究.pdf

1、宮頸癌是女性第二大惡性腫瘤，淋巴轉(zhuǎn)移是其獨立預后因素，也是宮頸癌患者死亡的主要原因。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學特征，尋找影響宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子標志物，探索其分子機制，將有助于宮頸癌轉(zhuǎn)移的早期診斷及治療[1]。
　　 巨噬細胞移動抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor, MIF)是許多炎癥和免疫反應的重要調(diào)節(jié)因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[2]。但MIF促進腫瘤細

2、胞浸潤轉(zhuǎn)移的具體作用機制及其通過何種途徑影響宮頸癌細胞的生物學行為尚不完全清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MIF在宮頸癌細胞株Caski中高表達，在SiHa細胞中低表達，并發(fā)現(xiàn)MIF在宮頸癌細胞中通過自分泌調(diào)節(jié)細胞活性，通過旁分泌促進細胞的增殖分化、浸潤及轉(zhuǎn)移，MIF及其相關(guān)因子可能通過ERK/MAPK、PI3K/Akt等信號傳導通路在早期宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用[3-5]。
　　 基于本課題組的前期研究，本研究利用基因重組技術(shù)，介

3、導目的基因MIF轉(zhuǎn)染至人宮頸癌SiHa細胞，檢測MIF及其相關(guān)因子IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1的表達，以及對細胞增殖、侵襲遷移能力的影響，進而探討MIF在宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用機制，以期為下一步宮頸癌的基因診斷和治療提供良好的實驗基礎。
　　 目的:研究重組真核表達載體pEGFP-N1-MIF轉(zhuǎn)染人宮頸癌細胞SiHa后對MIF及其相關(guān)因子IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1表達的影響，以及對S

4、iHa細胞生物學特性的影響，探討MIF在宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用機制。
　　 方法:
　　 1.利用真核表達載體pEGFP-N1構(gòu)建重組真核表達載體pEGFP-N1-MIF，應用Xho(I)、BamH(I)雙酶切及序列測定鑒定pEGFP-N1-MIF。
　　 2.采用脂質(zhì)體法將重組真核表達載體pEGFP-N1-MIF轉(zhuǎn)染至低表達MIF的SiHa細胞中，熒光顯微鏡下觀察其轉(zhuǎn)染情況。ELISA法檢測各組細胞（轉(zhuǎn)染重組質(zhì)

5、粒pEGFP-N1-MIF的實驗組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1的陰性對照組、未轉(zhuǎn)染的空白對照組）上清液中MIF蛋白的表達;Real-time PCR及免疫細胞化學法檢測各組細胞中MIF mRNA及蛋白的表達水平。
　　 3.Real-time PCR及免疫細胞化學法檢測各組細胞中IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1 mRNA及蛋白的表達水平;通過MTT、軟瓊脂集落形成實驗、Boyden小室趨化實驗、細胞劃痕遷移實驗

6、觀察MIF過表達對SiHa細胞生物學特性的影響。
　　 4.應用NF-κB抑制劑PDTC干預SiHa細胞，免疫細胞化學法檢測MIF、IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1的蛋白表達情況;MTT、軟瓊脂集落形成實驗、Boyden小室趨化實驗、細胞劃痕遷移實驗檢測PDTC干預后SiHa細胞生物學特性的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.重組真核表達載體pEGFP-N1-MIF經(jīng)雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳可見約4

7、.7 kb、348 bp處兩條清晰條帶;序列測定結(jié)果與目的序列相同。
　　 2.轉(zhuǎn)染6h后，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-MIF的實驗組和轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的陰性對照組細胞即可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，且熒光強度隨時間增加而逐漸增強，48h時熒光最亮;ELISA證實實驗組細胞上清液中MIF表達均高于各對照組(P＜0.05);Real-time PCR及免疫細胞化學法證實實驗組細胞中MIF mRNA和蛋白的表達水平均高于各對照組(P

8、＜0.05）。
　　 3.Real-time PCR及免疫細胞化學法檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染48h后，實驗組細胞中IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1 mRNA和蛋白的表達均明顯增高，與陰性對照組、空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;且MIF與IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1 mRNA和蛋白之間存在正相關(guān)(P＜0.05)，NF-κB與IL-8、Bcl-2、CyclinD1 mRNA和蛋白之

9、間存在正相關(guān)（P＜0.05），IL-8與Bcl-2、CyclinD1mRNA和蛋白之間也存在正相關(guān)（P＜0.05）。
　　 MTT法檢測結(jié)果顯示:實驗組與陰性對照組、空白對照組相比，轉(zhuǎn)染后SiHa細胞的增殖作用明顯增強(P＜0.05），且隨轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時間延長，促增殖作用更加明顯;而陰性對照組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果顯示:實驗組與各對照組相比，克隆形成數(shù)明顯增多(P

10、＜0.05)，而陰性對照組與空白對照組間無顯著差異（P＞0.05）。
　　 Boyden小室趨化實驗結(jié)果顯示:實驗組、陰性對照組、空白對照組細胞在每個視野的平均穿膜細胞數(shù)分別為(268.930±7.923)個、(108.070±5.271)個、(111.930±4.464)個。實驗組與各對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而陰性對照組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 劃痕遷移實驗顯示

11、實驗組細胞遷移率明顯高于各對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而陰性對照組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 4.NF-κB抑制劑PDTC干預SiHa細胞后，MIF、IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1的蛋白表達受到明顯抑制;且MIF與IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1蛋白表達存在正相關(guān)(P＜0.05)，NF-κB與IL-8、Bcl-2、CyclinD1蛋白表達存在正相

12、關(guān)(P＜0.05)，IL-8與Bcl-2、CyclinD1蛋白表達也存在正相關(guān)(P＜0.05)。
　　 MTT法結(jié)果顯示:運用PDTC在不同濃度、不同時間干預下，其對SiHa細胞的抑制率呈時間-劑量關(guān)系，100μmol/L PDTC明顯抑制SiHa細胞的增殖活性，且在72 h時其抑制作用最為明顯。
　　 軟瓊脂集落形成實驗發(fā)現(xiàn)，細胞培養(yǎng)3天后，在相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)實驗組細胞有小集落形成，而加PDTC抑制劑組未發(fā)現(xiàn)集落形

13、成。隨培養(yǎng)時間延長實驗組集落逐漸增多增大，且分布于不同層面;而加PDTC抑制劑組集落明顯變小，并且隨著PDTC濃度的增加，集落形成數(shù)逐漸減少。
　　 Boyden小室趨化實驗結(jié)果顯示:隨著PDTC濃度的增高，穿膜細胞數(shù)減少。
　　 細胞劃痕遷移實驗顯示:細胞遷移率隨抑制劑PDTC濃度的增加逐漸變小。100μmol/LPDTC干預pEGFP-N1-MIF-SiHa細胞后，劃痕寬度無明顯變化。
　　 結(jié)論:
　

14、　 1.重組真核表達載體pEGFP-N1-MIF構(gòu)建成功。
　　 2.轉(zhuǎn)染重組真核表達載體pEGFP-N1-MIF后SiHa細胞中MIF過表達。
　　 3.MIF過表達可上調(diào)IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1的表達，并增強SiHa細胞體外增殖、侵襲遷移能力。
　　 4.PDTC明顯抑制MIF、IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1的表達，并抑制SiHa細胞體外增殖、侵襲遷移能力。

15、r>　　 5.MIF與IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1之間，NF-κB與IL-8、Bcl-2、CyclinD1之間，IL-8與Bcl-2、CyclinD1之間均存在正相關(guān)，推測MIF可能通過NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)IL-8、Bcl-2、CyclinD1等下游因子的基因表達，而IL-8又可與相應受體結(jié)合，激活NF-κB通路促進Bcl-2、CyclinD1等下游因子的基因表達，從而促進宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。