MIF轉染宮頸癌SiHa細胞株及對其血管生成作用的影響.pdf

1、宮頸癌是女性第二大惡性腫瘤，全球發(fā)病率僅次于乳腺癌。近年來其發(fā)病呈現出明顯年輕化的趨勢，嚴重威脅著女性的健康和生存質量。巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)是多效能的細胞因子，在炎癥、免疫反應及腫瘤的發(fā)展過程中起著關鍵作用。目前研究認為MIF是重要的促腫瘤因子，與多種腫瘤的侵襲、轉移、臨床分期及預后密切相關。本課題組前期實驗證實與Caski細胞株相比，SiHa細胞

2、株中MIF表達較低，進行體外實驗表明MIF可能通過促進宮頸癌細胞增殖、轉移、血管生成及抑制宮頸癌細胞凋亡等機制促進宮頸癌的侵襲轉移。
　　 目的:構建表達綠色熒光的pEGFP-N1/MIF真核表達載體，探討過表達MIF對宮頸癌SiHa細胞中NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9表達的影響，進一步探討MIF在宮頸癌細胞血管生成中的作用，初步探索MIF通過NF-κB信號通路在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制，可能為宮頸癌的診治提供理論依

3、據。
　　 方法:
　　 1.化學合成MIFcDNA，設計含XhoⅠ和BamH(Ⅰ)酶切位點的引物序列，利用PCR方法擴增MIF基因片段，構建人pEGFP-N1/MIF真核表達載體;用脂質體轉染法將其轉染到宮頸癌SiHa細胞株中，熒光顯微鏡下觀察轉染效率，采用ELISA法檢測轉染前后各組上清液中MIF蛋白的表達，用熒光定量PCR法和免疫細胞化學法檢測轉染前后各組細胞中MIF mRNA和蛋白表達情況。
　　 2.M

4、TT法檢測轉染前后細胞增殖能力的變化，熒光定量PCR法和免疫細胞化學法檢測轉染前后各組細胞中NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9 mRNA和蛋白表達情況。
　　 3.用NF-κB抑制劑PDTC處理pEGFP-N1/MIF/SiHa細胞，采用MTT法檢測抑制前后各組細胞增殖能力的變化，采用免疫細胞化學法檢測抑制前后各組細胞中MIF、NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9蛋白表達情況。
　　 結果:
　　 1.

5、經過酶切及DNA測序鑒定證實pEGFP-N1/MIF真核表達載體構建成功。利用脂質體轉染pEGFP-N1/MIF/SiHa真核表達載體6h后即可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，轉染48 h后熒光強度最強，轉基因效率約為（61±2.0）％;ELISA檢測結果顯示轉染pEGFP-N1/MIF組細胞上清液中MIF蛋白表達明顯升高(P＜0.05);熒光定量PCR、免疫細胞化學檢測結果顯示轉染pEGFP-N1/MIF組細胞中MIF mRNA和蛋白表

6、達均過表達(P＜0.05)。
　　 2.MTT實驗結果顯示轉染pEGFP-N1/MIF組細胞增殖能力明顯增強(P＜0.05);熒光定量PCR、免疫細胞化學檢測結果顯示轉染pEGFP-N1/MIF組細胞中NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9 mRNA和蛋白表達均過表達(P＜0.05)。
　　 3.NF-κB抑制劑作用于pEGFP-N1/MIF/SiHa細胞后，MTT實驗結果顯示轉染pEGFP-N1/MIF組細胞增殖能力

7、明顯減弱(P＜0.05);免疫細胞化學結果顯示細胞中MIF、NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9蛋白表達均明顯下調，與對照組相比差異有顯著性（P＜0.05）。
　　 4.Pearson相關分析顯示:MIF與IL-8、NF-κB、VEGF、MMP9之間，NF-κB與IL-8、VEGF、MMP9之間，IL-8與VEGF、MMP9之間均存在正相關（P＜0.05）。
　　 結論:
　　 1.將構建成功的pEGFP-N

8、1/MIF真核表達載體轉染宮頸癌SiHa細胞能顯著上調細胞中MIF的表達;
　　 2.MIF可以明顯增強宮頸癌SiHa細胞的增殖能力，并且顯著上調細胞中NF-κB、IL-8、VEGF、MMP9 mRNA和蛋白的表達;
　　 3.NF-κB抑制劑PDTC能顯著抑制細胞的增殖能力，并且下調pEGFP-N1/MIF/SiHa細胞中MIF、IL-8、NF-κB、VEGF、MMP9蛋白的表達。
　　 4.MIF與NF-κB