環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速檢測水產(chǎn)動物病原的研究.pdf

1、隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，水產(chǎn)動物的病害越發(fā)嚴重，成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的瓶頸因素之一。水產(chǎn)病原的快速診斷，對水產(chǎn)養(yǎng)殖的良種選育，疾病預(yù)防、進出口檢疫、水產(chǎn)品食品安全等方面具有重大意義。由于各自的缺陷，常規(guī)的病原檢測技術(shù)大都不適合養(yǎng)殖基層的現(xiàn)場快速檢測。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)是一種新的DNA擴增方法。該技術(shù)依賴于自動循環(huán)的鏈置換反應(yīng)，通

2、過識別靶序列上6個特異區(qū)域的引物和具有鏈置換的DNA聚合酶，在等溫條件下，不到1h就能擴增出109靶序列拷貝，具有特異、靈敏、快速、簡便等特點，適合于養(yǎng)殖基層的現(xiàn)場快速檢測。
　　 本研究新建了環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法分別快速檢測對蝦白斑綜合征病毒、皮下及造血組織壞死病毒和弧菌。首次進行了白斑綜合征病毒和皮下及造血組織壞死病毒進行同時檢測的研究，以及首次對某一類特定病原體進行通用LAMP檢測研究，研究了LAMP對弧菌屬細菌的通用性檢測

3、。設(shè)計不同病原相應(yīng)的檢測引物，分別對其反應(yīng)條件（鎂離子濃度、甜菜堿濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度等）進行了優(yōu)化，并檢測了其特異性及靈敏度。首次將dUTP-UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）技術(shù)引入LAMP檢測中，克服了LAMP反應(yīng)極易產(chǎn)生假陽性的缺點，并對dUTP對dTTP的替代率、替代對反應(yīng)靈敏度的影響進行了研究。并將建立好的LAMP檢測方法用于實際水產(chǎn)動物樣品的病原檢測。具體結(jié)論如下:
　　 1、優(yōu)化后的白斑綜合征病毒LAMP反應(yīng)體

4、系在64℃下45 min即能有理想擴增效果。加入SYBR GreenⅠ后，能用肉眼進行結(jié)果的判斷。使用常見細菌和對蝦病毒做對照，顯示LAMP反應(yīng)對WSSV檢測具有很好的特異性。靈敏度達到100 copies/μl，比巢式PCR高100倍。反應(yīng)中使用dUTP替代部分dTTP，結(jié)合UNG酶，可以避免LAMP的產(chǎn)物遺留污染的問題，但替代率高于50％后，顯著抑制反應(yīng)的擴增效率。在對蝦樣品的WSSV檢測中，LAMP方法表現(xiàn)出比巢式PCR更好的檢測

5、靈敏度和更快速的檢測流程。
　　 2、皮下及造血組織壞死病毒LAMP反應(yīng)體系在65℃反應(yīng)60 min完成擴增反應(yīng)。產(chǎn)物經(jīng)熒光染色后發(fā)生顏色變化，產(chǎn)物檢測方便。對擴增產(chǎn)物進行酶切得到與預(yù)期相吻合的片段。50％的dUTP替代和UNG酶的使用能避免假陽性的發(fā)生，但會使反應(yīng)靈敏度下降10倍。LAMP反應(yīng)對IHHNV具有較好的特異性。其LAMP靈敏度較普通PCR高1000倍。對實際對蝦樣品的IHHNV檢測中，LAMP方法于PCR方法結(jié)果一

6、致，但表現(xiàn)出更高的效率和更加直觀準確的結(jié)果。
　　 3、優(yōu)化后的WSSV和IHHNV多重LAMP反應(yīng)體系需在65℃反應(yīng)60 min。產(chǎn)物經(jīng)過酶切得到的與預(yù)期大小相吻合的條帶。多重LAMP具有較好的特異性和較高的靈敏度，比巢式PCR高兩個數(shù)量級，較普通PCR高三個數(shù)量級。在實際對蝦樣品的檢測中，多重LAMP檢測較PCR檢測具有更高的病毒檢出率和更高的檢測效率。
　　 4、優(yōu)化后的弧菌屬細菌通用LAMP檢測的反應(yīng)體系需在62