環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)技術(shù)快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)簡稱金葡菌,是食品中常見的污染菌,該菌認為是引起細菌性食物中毒最普遍的因為之一。國內(nèi)外由金葡菌引發(fā)的食物中毒屢屢發(fā)生,金葡菌所引起的食物中毒已日益成為全球性的公共衛(wèi)生問題,嚴重危害人類安全與健康。因而,應(yīng)該建立一種方便快捷的檢測金葡菌的方法是食品安全問題中的一項重要的舉措,可以起到防患于未然。
　　 目前針對金葡菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)檢測方法,免疫學(xué)方法和PCR方法。傳

2、統(tǒng)檢測方法操作繁瑣,檢測時間長,且靈敏度較低；免疫學(xué)方法的特異性和靈敏度也不是很理想,PCR方法敏感、快速,但是由于需要昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的電泳過程,而使其難以在基層普及和推廣。
　　 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法(LAMP)是一種由日本科學(xué)家Notomi開發(fā)的新型的核酸擴增技術(shù),可以擴增特異性核酸序列,具有高特異性、高靈敏性,簡便快速和成本低的特點,已在諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。
　　 本試驗是采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速檢測食品中金葡

3、菌。以金葡菌的高度保守序列-耐熱核酸酶nuc序列為靶基因,運用在線引物設(shè)計軟件(https:／／primerexplorer.jp／lamp3.0.0／index.html)設(shè)計LAMP引物。對鎂離子濃度、dNTPs濃度、反應(yīng)時間等擴增條件進行優(yōu)化,確定25μL的LAMP反應(yīng)體系為:內(nèi)引物(FIP和BIP)各1.6mmol／L,外引物(F3和B3)各0.4mmol／L,環(huán)引物(LB和LF)各0.8mmol／L,4.0mmol／L dNT

4、Ps,3mmol／L MgSO4,10×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液,8U的Bst DNA聚合酶大片段,2.5μL DNA模板,并用滅菌雙蒸水補足體系。LAMP的反應(yīng)過程為:先在64℃水浴鍋中反應(yīng)20min,然后在80℃水浴鍋中水浴10min終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀即可判斷LAMP反應(yīng)是否發(fā)生,亦可通過瓊脂糖凝膠電泳證實反應(yīng)是否發(fā)生。
　　 為了比較LAMP檢測金葡菌的靈敏度和人工污染檢出限,以P

5、CR方法作對照。PCR反應(yīng)的引物是[AMP反應(yīng)的兩條外引物(F3和B3)。結(jié)果表明,LAMP檢測金葡菌的靈敏度為1.25CFU／反應(yīng)管(2.5x101CFU／mL),人工污食品的檢出限為10.3CFU／反應(yīng)管(2.06×102CFU／mL)。PCR檢測金葡菌的靈敏度為1.25×102 CFU／反應(yīng)管(2.5×103CFU／mL),人工污染食品的檢出限為1.03×103 CFU／反應(yīng)管(2.06x104CFU／mL)。采用試劑盒法提取DN

6、A,從樣品處理到報告結(jié)果,LAMP方法耗時1h,PCR方法耗時3h。利用LAMP方法對40株腸道致病菌進行特異性試驗。結(jié)果表明,24株金葡菌為陽性,其它16株非金葡菌為陰性。
　　 初步研究了8種模板制備方法對LAMP檢測食品中金葡菌的影響。結(jié)果表明,LAMP方法對制備模板DNA的要求不高。通過對實際樣品進行檢測,將本方法與國家標準GB／T4789.10-2010方法進行比較,確定LAMP方法敏感性為100％,特異性為97.93