環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)在霍亂弧菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用與研究.pdf

1、研究目的
　　 霍亂弧菌是嚴(yán)重威脅著人們健康的重要腸道致病菌,在我國(guó)被列為甲類“2號(hào)”傳染病原菌,每年衛(wèi)生部門(mén)花費(fèi)大量人力物力用于霍亂的疾病預(yù)防與病原檢測(cè)。本研究就是利用LAMP技術(shù)開(kāi)發(fā)、建立快速、可靠、簡(jiǎn)便的霍亂弧菌檢測(cè)方法,以便于在基層單位推廣使用,為霍亂疫情監(jiān)測(cè)與預(yù)防提供更為及時(shí)的應(yīng)急檢測(cè)服務(wù)和參考結(jié)果。
　　 研究主要內(nèi)容和方法
　　 通過(guò)參閱文獻(xiàn)資料,研究LAMP的技術(shù)細(xì)節(jié)與過(guò)程,確定特異的霍亂弧菌基因

2、作為目標(biāo)基因,建立基礎(chǔ)的LAMP反應(yīng)實(shí)驗(yàn)體系。通過(guò)Genbank檢索、下載霍亂弧菌基因序列,使用BLAST、GENtle、DNAMan等相關(guān)核酸序列分析軟件比對(duì)分析確定具有鑒定意義的霍亂弧菌基因序列作為目標(biāo)序列,使用專門(mén)的LAMP引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer v4針對(duì)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)特異的霍亂弧菌LAMP引物。以SYBR GreenⅠ作為熒光劑在熒光定量PCR儀上實(shí)時(shí)檢測(cè)LAMP反應(yīng)結(jié)果,作為本研究開(kāi)發(fā)、建立霍亂弧菌的LAMP快

3、速檢測(cè)方法的主要研究方式。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)溫度、時(shí)間、組成濃度等實(shí)驗(yàn)條件對(duì)LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn)。通過(guò)與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定方法和PCR方法比較進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià),前者為霍亂防治手冊(cè)(衛(wèi)生部1996年)規(guī)定的常規(guī)方法,后者系以霍亂弧菌ace,rtxA和ctxA為目標(biāo)基因的普通PCR方法。
　　 研究結(jié)果
　　 本研究建立的霍亂弧菌LAMP快速檢測(cè)方法以霍亂弧菌的外分泌蛋白系統(tǒng)M亞單位的編碼基因epsM和霍亂毒素A亞單位的編碼基因

4、ctxA為目標(biāo)基因,前者具有良好的霍亂弧菌種特異性,后者用于檢測(cè)產(chǎn)霍亂毒素的霍亂弧菌菌株。本方法使用epsM引物和ctxA引物,從8個(gè)種屬的20株實(shí)驗(yàn)菌株中分別正確地檢出所有13株霍亂弧菌菌株和所有5株產(chǎn)霍亂毒素的霍亂弧菌菌株,對(duì)菌株純培養(yǎng)物的檢出限分別達(dá)到了12.5cfu/μl(25cfu/reaction)和5cfu/μl(10cfu/reaction),明顯低于其它比較的兩種方法,尤其傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法,PCR方法的檢出限分別為1

5、00cfu/reaction(rtxA)和50cfu/reaction(ctrA)。方法學(xué)評(píng)價(jià)方面,從75份實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看,本研究建立的LAMP方法與比較的PCR方法的霍亂弧菌檢出率沒(méi)有明顯差異(x2=0.500,P＞0.05,α2-side=0.05,Kappa=0.894.),但兩者明顯高于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定方法(P＜0.05,α2-side=0.05)。
　　 結(jié)論
　　 與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定方法相比,本研