環(huán)介導等溫擴增法快速和實時檢測金黃色葡萄球菌的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是引起細菌性食物中毒和院內(nèi)感染的一種主要病原菌。因此，對金黃色葡萄球菌的檢測技術的開發(fā)具有較高的應用價值。環(huán)介導恒溫擴增方法(LAMP)擴增特異性核酸序列，具有高特異性、高靈敏性、簡便、快速和低成本的特點，已在諸多領域廣泛應用。本文選擇了金黃色葡萄球菌穩(wěn)定攜帶的特異基因——凝固酶編碼基因coa作為LAMP方法檢測的靶序列，并針對coa基因使用Primer_Premier_v5軟件通過與GeneBank已公布的93條同源序列

2、的比對結果設計了特異性LAMP引物。引物序列分別為：F3，5'-GCTGGCCCAACACAAAACAAG-3'；B3，5'-GTCGCAGTACCATCTGCATG-3'；FIP，5'-CGCTTGGCTTCTTGTATGTCGGGCGCATATAACGTAACAACACATG-3'；BIP，5'-CAACGTACAACACATGCAAATGGGCGTTTGTTTCGCTTGGC-3'；LF，5'-GGTCAAGTATCATACGG-

3、3'；LB，5'-CATATGGCGCTCGCCCGACAC-3'。
　　 本文對LAMP用于檢測金黃色葡萄球菌的技術方法、檢測效果和實際應用進行了研究：確定了金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)方法、菌體計數(shù)方法、染色體DNA提取，并制備了菌裂解液和DNA提取液，分別作為LAMP檢測的模板。通過對反應體系各成分濃度的摸索確定最佳反應體系。通過對金黃色葡萄球菌的4株標準菌株、7株分離株和33株非金葡菌菌株的檢測證明本方法具有良好的特異性。本實驗

4、獲得的檢測低限為5.6×101CFU/管，其靈敏度比普通PCR方法至少提高了100倍?；蚺c實時熒光PCR儀相結合，通過檢測已知模板濃度的10倍梯度稀釋液并對其時間閾值做線性回歸，得線性方程y=-1.8721n(x)+54.5 andR2=0.9887，再通過實際樣品的時間閾值實現(xiàn)半定量檢測，實時LAMP的檢測限更是達到了1.4 CFU/管。本方法將快速細菌培養(yǎng)、簡化的三步法基因組抽提和環(huán)介導等溫擴增結合起來，可以短暫增菌、微波裂解細菌釋