重組人IL-38的制備及其抑制小鼠肺纖維化的作用.pdf

1、目的：克隆人白細胞介素(interleukin，IL)-38基因，構(gòu)建其真核、原核表達載體，完成 IL-38重組蛋白的表達、純化及活性分析；構(gòu)建 IL-38慢病毒表達載體，并進行其慢病毒包裝與鑒定，研究 IL-38對博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的作用及機制。
　　方法：從人皮膚組織中提取總RNA，通過RT-PCR方法擴增IL-38基因的全長編碼序列，將其克隆入真核表達載體 pcDNA3.1/V5-His-TOPO，構(gòu)建其 pcDNA

2、-3.1-hIL-38-V5-His重組質(zhì)粒；以pcDNA-3.1-hIL-38-V5-His為模板擴增IL-38成熟蛋白編碼區(qū)，構(gòu)建IL-38 pET-44-hIL-38原核表達載體，將測序正確的表達載體轉(zhuǎn)化入 BL21(DE3)大腸桿菌表達菌株中獲得 IL-38表達工程菌株，用適當濃度的IPTG誘導(dǎo)工程菌株表達IL-38重組蛋白，并利用其C末端的組氨酸標簽(His-tag)進行鎳離子親和層析純化目的蛋白，將純化的重組IL-38作用于

3、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的THP-1細胞，研究純化IL-38蛋白的生物學(xué)活性；構(gòu)建IL-38慢病毒表達載體 pLVX-hIL-38-IRES-Green1，將該重組表達載體與其余三個包裝載體共轉(zhuǎn)染293T細胞株，包裝并收集慢病毒，建立博來霉素(bleomycin，BLM)滴鼻給藥C57BL/6雄性小鼠誘導(dǎo)的肺纖維化動物模型，將 IL-38病毒上清滴鼻小鼠，研究 IL-38對小鼠肺纖維化發(fā)病的影響。

4、>　　結(jié)果：構(gòu)建的IL-38真核、原核及慢病毒表達載體的測序結(jié)果均與 GenBank中的基因序列一致；IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-38蛋白主要以可溶性形式存在，純化的目的蛋白經(jīng) SDS-PAGE凝膠電泳分析和Western blot鑒定發(fā)現(xiàn)，蛋白純度可達98％，細胞實驗證明純化的目的蛋白具有較高的生物學(xué)活性；動物實驗結(jié)果表明，IL-38可減少肺部炎癥細胞的浸潤、細胞外基質(zhì)及膠原的沉積，可改善肺肺泡壁結(jié)構(gòu)，可抑制腫瘤壞死因子(tumor ne

5、crosis factor，TNF)-α、IL-4、IL-6、IL-17、單核細胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein，MCP)-1、巨噬細胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)-2、粒-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)等前炎癥因子和促纖維化因子的產(chǎn)生，也可促進