GPC5對人肺腺癌細胞生物學行為的影響.pdf

1、目的:
　　肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，一項多中心的全基因組關聯(lián)研究(GWAS)發(fā)現(xiàn)位于13q31.3位點的磷脂酰肌醇蛋白聚糖5(glypican-5，GPC5)可能增加患肺腺癌的風險。目前在哺乳類基因組中共發(fā)現(xiàn)GPC1到GPC6的6個磷脂酰肌醇蛋白聚糖成員，均歸屬于磷脂酰肌醇蛋白聚糖(heparan sulphate proteoglycans，HSPGs)大類，HSPGs主要通過糖基-磷脂酰肌醇錨錨定在細胞膜的表面，從而在細胞

2、生長及分化中扮演重要角色。對于GPC5基因的研究發(fā)現(xiàn)，GPC5基因的高表達或低表達與人體多部位、多種類型的腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關，例如淋巴瘤、橫紋肌肉瘤及結腸癌等。但關于GPC5如何在肺腺癌中發(fā)揮作用及其在細胞水平對肺腺癌細胞生物學活動的影響如何，當前尚存在爭議。本課題構建GPC5相關的肺腺癌細胞模型，全面研究GPC5對肺腺癌細胞生物學活動的促進或抑制作用，從而為進一步探索GPC5在肺腺癌中的功能定義及分子機制探索提供理論依據(jù)。
　　

3、方法:
　　1.采用逆轉錄PCR(RT-PCR)、實時定量RT-PCR(qRT-PCR)分析肺腺癌細胞系中GPC5基因mRNA表達情況;同時，采用Western blot(WB)的方法驗證肺腺癌細胞系中GPC5基因在蛋白水平的不同表達情況。
　　2.利用真核載體構建GPC5過表達載體及干擾載體，并通過脂質體法將GPC5過表達載體及干擾載體轉入細胞，構建GPC5過表達及GPC5沉默細胞模型。
　　3.利用CCK-8法觀察

4、GPC5過表達及沉默對細胞生長情況的影響。
　　4.通過流式細胞熒光分析的方法，探究GPC5過表達及沉默對細胞周期及凋亡的相關影響。
　　5.通過Transwell小室系統(tǒng)觀察肺腺癌細胞的侵襲及遷移活動，探究GPC5過表達及沉默對細胞遷移能力和侵襲能力的相關影響。
　　結果:
　　1.檢測GPC5基因在4株人肺腺癌細胞系（A549、H1299、H358和H1975）和正常肺組織中的mRNA表達情況，發(fā)現(xiàn)與正常肺組

5、織相比，GPC5基因的表達量在這4株人肺腺癌細胞系中均較低;僅對基因表達的細胞系之間的比較分析，發(fā)現(xiàn)在A549細胞中GPC5基因低表達，在H1299細胞中則高表達;對蛋白表達的檢測分析與mRNA水平一致。
　　2.通過前期mRNA及蛋白表達檢測，選取A549細胞完成GPC5過表達細胞系模型的建立及鑒定工作，選取H1299細胞完成GPC5沉默細胞系模型的建立及鑒定工作。
　　3.與陰性對照組比較分析，GPC5過表達細胞系生長受

6、到抑制，轉染后第三天抑制作用最強，對照組細胞生長曲線OD值為2.21±0.09，過表達組OD值為1.51±0.07;GPC5沉默細胞系細胞生長得到促進，轉染后第四天促進效果最明顯，對照組細胞生長曲線OD值為1.81±0.07，干擾組OD值為2.51±0.05，兩組的差異比較均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　4.GPC5基因過表達引起A549細胞G1期增加，G2、S期降低，與對照組相比G1期和S期變化差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0

7、.05); GPC5基因沉默引起H1299細胞G1、G2期下降，S期增高，與對照組G1期和S期比率變化差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　5.與陰性對照相比，GPC5基因過表達細胞總凋亡率由10.03％降到8.99％，但差異不具有統(tǒng)計學意義，同樣在GPC5沉默細胞系H1299中也未觀察到細胞總凋亡率之間的差異。
　　6.GPC5過表達實驗組遷移到膜下側的細胞數(shù)明顯減少，穿膜細胞數(shù)為（28.2±2.5），陰性對照組則為（

8、59.6±1.81）。同時對于GPC5沉默實驗組，GPC5沉默實驗組穿膜細胞數(shù)呈現(xiàn)增加的趨勢，沉默組細胞的穿膜細胞數(shù)為（14±2），陰性對照組則為（2.33±0.58），與陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　7.GPC5過表達實驗組穿過基質膠后進入膜下側的細胞數(shù)明顯減少，過表達實驗組穿膜細胞數(shù)（9.2±0.7），陰性對照組（20.3±2）。同時對于GPC5沉默實驗組，GPC5沉默組的穿膜細胞數(shù)呈現(xiàn)增加的趨勢，