細(xì)絲蛋白A下調(diào)對HER2陽性乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：
　　乳腺癌在女性腫瘤中引起的發(fā)病率及死亡率最高，嚴(yán)重危害女性健康。乳腺癌是一種全身性疾病，其中HER2陽性乳腺癌是指免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）檢測HER2（humanepidermalgrowthfactorreceptor-2)+++，或原位雜交（insituhybridization，ISH）檢測為陽性的乳腺癌。20％～30%的乳腺癌中存在HER2過表達，HER2陽性乳腺癌的惡性程

2、度高，易出現(xiàn)局部或遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，HER2陽性乳腺癌同樣作為一種異質(zhì)性群體存在。根據(jù)2013版乳腺癌的分子分型，大部分HER2陽性乳腺癌為HER2陽性型（非Luminal型），一小部分屬于LuminalB型中的LuminalB-like（HER2陽性）型，預(yù)后較差。對于HER2陽性乳腺癌常規(guī)予以抗HER2治療，但有效率不高。如何提高HER2陽性乳腺癌的治療效果，尋找更加有效的治療措施，已成為乳腺癌治療的重點和

3、難點。因此，進一步探索HER2陽性乳腺癌的發(fā)病機制，尋找有效的乳腺癌治療方法勢在必行。
　　表皮生長因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）屬于受體酪氨酸激酶（receptortyrosinekinase，RTK）家族，它的成員包括：ErbB-1/EGFR、ErbB-2/HER2、ErbB-3/HER3和ErbB-4/HER4，與乳腺癌的發(fā)生、進展及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。表皮生長因子受體通過與配體（

4、如EGF）結(jié)合形成同源或異源二聚體，進而激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如MAPK/ERK、PI3K/Akt等，最終促進腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成。至今仍未發(fā)現(xiàn)HER2有明確的配體，但它可與EGFR家族中其他成員形成異源二聚體或自身形成同源二聚體。HER2在多種組織中均有表達，如乳腺、胃、結(jié)直腸等，生理情況下調(diào)控著組織內(nèi)細(xì)胞的增殖和分化,而異?；罨瘎t會導(dǎo)致腫瘤生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。研究報道，HER2過表達是乳腺癌預(yù)后不良的獨立預(yù)測指標(biāo)。因此，

5、HER2成為了一個重要治療靶點。目前針對HER2的分子靶向藥物如曲妥珠單抗、帕妥珠單抗等已應(yīng)用于乳腺癌的臨床治療，但其單獨應(yīng)用的有效率不高且存在耐藥問題，提示在HER2過表達的乳腺癌中仍有未知的信號分子調(diào)節(jié)HER2信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，對乳腺癌的發(fā)生具有重要影響。
　　細(xì)絲蛋白A（FilaminA，F(xiàn)LNa）又稱肌動蛋白結(jié)合蛋白280（actin-bindingprotein280，ABP-280），分子量280kDa，由Stossel

6、等首次發(fā)現(xiàn)于非肌肉組織的肌動蛋白細(xì)絲交聯(lián)蛋白中。全長的FLNa主要定位于細(xì)胞質(zhì)，容易發(fā)生蛋白分解。其90kDa的裂解片段可以定位于細(xì)胞核。FLNa是“V”形的同型二聚體，由肌動蛋白結(jié)合區(qū)、24個重復(fù)的β-折疊片層和2個絞鏈區(qū)組成。FLNa的特殊結(jié)構(gòu)決定其具有強大的功能：FLNa分子可交聯(lián)肌動蛋白絲形成穩(wěn)定的細(xì)胞骨架，并與多種細(xì)胞膜蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)如MAPK/ERK、PI3K/Akt等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，最終影響腫瘤細(xì)胞的增殖、粘附、遷

7、移和侵襲等生物學(xué)行為。Zhu等認(rèn)為FLNa可以調(diào)控人惡性黑色素瘤細(xì)胞EGFR的活化，EGFR與HER2屬同一家族，而FLNa能否參與HER2陽性乳腺癌細(xì)胞的活化目前并無相關(guān)報道。
　　本研究擬通過：（1）用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立下調(diào)FLNa的HER2陽性乳腺癌MDA-MB-453穩(wěn)定細(xì)胞株；（2）采用MTS法、劃痕修復(fù)實驗、Transwell法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲能力；（3）采用Westernblot法，檢測HER2及其

8、下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中各激酶的活化水平。意在從細(xì)胞、分子水平探討FLNa對HER2陽性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453增殖、遷移和侵襲的調(diào)節(jié)機制，研究FLNa下調(diào)對HER2活化及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，為更精準(zhǔn)地治療HER2陽性乳腺癌提供有效的靶點。
　　方法：
　　1、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建下調(diào)FLNa的穩(wěn)定細(xì)胞株
　　將FLNashRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人HER2陽性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453中，經(jīng)嘌呤霉素篩選，獲得下調(diào)FLNa的

9、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株（MDA-MB-453/KD）及其對照組細(xì)胞株（MDA-MB-453/Ctrl）；利用Westernblot檢測其中FLNa的蛋白水平。
　　2、MTS法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的增殖能力
　　將MDA-MB-453/KD及MDA-MB-453/Ctrl細(xì)胞消化后各自接種到96孔板中，饑餓培養(yǎng)4h后，予不同濃度EGF（0nM、4nM、20nM、100nM）分別刺激培養(yǎng)48h，加入MTS，酶標(biāo)儀上檢測各孔的OD值。通過

10、比較各組之間的差別來測定細(xì)胞的增殖情況。
　　3、通過劃痕修復(fù)實驗來檢測MDA-MB-453細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后的遷移情況
　　將MDA-MB-453/KD及MDA-MB-453/Ctrl細(xì)胞各自接種于24孔板，饑餓培養(yǎng)4h后，用10ul槍頭在底部劃痕。兩組細(xì)胞均分為無EGF刺激組和20nMEGF刺激組；置于顯微鏡下觀察劃痕修復(fù)情況，定時進行拍照，直至劃痕愈合。
　　4、Transwell實驗測定MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染后

11、的侵襲情況
　　將基質(zhì)膠鋪于Transwell小室的上室，MDA-MB-453/KD及MDA-MB-453/Ctrl兩組細(xì)胞消化后分別鋪于小室上室，在無FBS的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，下室放入含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)6天后；取出小室，用95%冰乙醇固定、HE染色，顯微鏡下拍照并計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。
　　5、Westernblot檢測HER2活化水平及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子的變化
　　將MDA-MB-453/KD

12、及MDA-MB-453/Ctrl細(xì)胞分別接種于35mm培養(yǎng)皿，無胎牛血清的1640培養(yǎng)基饑餓4h，經(jīng)20nMEGF刺激后，于不同時間（0min、5min、10min、30min）收集細(xì)胞，提取總蛋白；采用Westernblot檢測FLNa、p-HER2、HER2、p-Akt、Akt、p-ERK及ERK的水平，以?-actin作為內(nèi)參蛋白。
　　結(jié)果：
　　1、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中FLNa蛋白表達水平的檢測
　　采用Weste

13、rnblot檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中FLNa蛋白的表達水平，實驗結(jié)果如下，MDA-MB-453/KD細(xì)胞FLNa的相對表達量（0.60±0.05）明顯少于MDA-MB-453/Ctrl細(xì)胞（1.05±0.01），具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）。
　　2、檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力
　　2.1MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的增殖能力
　　采用MTS法檢測MDA-MB-453細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)后的增殖情況：各濃度EGF（0nM、

14、4nM、20nM、100nM）刺激的MDA-MB-453/KD組細(xì)胞的OD值（1.26±0.03，1.39±0.01，1.55±0.02，1.82±0.04）明顯高于MDA-MB-453/Ctrl組（0.88±0.02，0.98±0.03，1.07±0.14，1.38±0.09），具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）。
　　2.2MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的遷移能力
　　采用Woundhealing實驗測定MDA-MB-453

15、穩(wěn)轉(zhuǎn)株的遷移情況：無EGF刺激時，MDA-MB-453/KD細(xì)胞在不同時間點的遷移率（23.06±0.14%，23.26±0.14%，39.62±0.04%，47.16±0.16%）均明顯高于MDA-MB-453/Ctrl組（7.85±1.08%，7.85±1.87%，12.15±0.53%，20.93±1.39%），具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）；給予20nMEGF刺激時，MDA-MB-453/KD組細(xì)胞不同時間點的遷移率（30.16

16、±0.62%，36.59±0.77%，42.87±1.53%，50.00±0.00%）亦明顯高于MDA-MB-453/Ctrl組（13.34±0.51%，14.38±1.18%，15.80±1.56%，25.65±0.43%），有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）。
　　2.3MDA-MB-453穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的侵襲能力
　　采用Transwell實驗檢測MDA-MB-453穩(wěn)轉(zhuǎn)株的侵襲情況：MDA-MB-453/KD組平均穿膜細(xì)胞數(shù)（

17、3±0.23）明顯高于MDA-MB-453/Ctrl組（14±0.44），具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）。
　　3、MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HER-2活化水平及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子的變化
　　采用Westernblot實驗測定MDA-MB-453穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞在20nMEGF刺激0min、5min、10min、30min后各蛋白的表達水平：MDA-MB-453/KD組FLNa的表達量（0.22±0.02，0.25±0.03

18、，0.22±0.02，0.23±0.04）均明顯低于MDA-MB-453/Ctrl組（0.82±0.03，0.83±0.03，0.82±0.03，0.84±0.03），均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）；經(jīng)EGF刺激5min、10min、30min后p-HER2的水平（0.83±0.02，0.71±0.05，0.59±0.03）均明顯高于Ctrl組（0.42±0.05，0.17±0.01，0.07±0.03），均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）

19、；p-Akt的水平（0.84±0.05，0.63±0.04，0.46±0.03）均明顯高于Ctrl組（0.44±0.03，0.24±0.03，0.06±0.02），均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）；p-ERK的水平（0.83±0.02，0.86±0.02，0.79±0.02）均明顯高于Ctrl組（0.44±0.04，0.27±0.04，0.17±0.03），均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、下調(diào)FLNa的表