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文檔簡介
1、目的:
乳腺癌在女性腫瘤中引起的發(fā)病率及死亡率最高,嚴(yán)重危害女性健康。乳腺癌是一種全身性疾病,其中HER2陽性乳腺癌是指免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)檢測HER2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2)+++,或原位雜交(insituhybridization,ISH)檢測為陽性的乳腺癌。20%~30%的乳腺癌中存在HER2過表達,HER2陽性乳腺癌的惡性程
2、度高,易出現(xiàn)局部或遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,預(yù)后差。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),HER2陽性乳腺癌同樣作為一種異質(zhì)性群體存在。根據(jù)2013版乳腺癌的分子分型,大部分HER2陽性乳腺癌為HER2陽性型(非Luminal型),一小部分屬于LuminalB型中的LuminalB-like(HER2陽性)型,預(yù)后較差。對于HER2陽性乳腺癌常規(guī)予以抗HER2治療,但有效率不高。如何提高HER2陽性乳腺癌的治療效果,尋找更加有效的治療措施,已成為乳腺癌治療的重點和
3、難點。因此,進一步探索HER2陽性乳腺癌的發(fā)病機制,尋找有效的乳腺癌治療方法勢在必行。
表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)屬于受體酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase,RTK)家族,它的成員包括:ErbB-1/EGFR、ErbB-2/HER2、ErbB-3/HER3和ErbB-4/HER4,與乳腺癌的發(fā)生、進展及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。表皮生長因子受體通過與配體(
4、如EGF)結(jié)合形成同源或異源二聚體,進而激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,如MAPK/ERK、PI3K/Akt等,最終促進腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成。至今仍未發(fā)現(xiàn)HER2有明確的配體,但它可與EGFR家族中其他成員形成異源二聚體或自身形成同源二聚體。HER2在多種組織中均有表達,如乳腺、胃、結(jié)直腸等,生理情況下調(diào)控著組織內(nèi)細(xì)胞的增殖和分化,而異?;罨瘎t會導(dǎo)致腫瘤生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。研究報道,HER2過表達是乳腺癌預(yù)后不良的獨立預(yù)測指標(biāo)。因此,
5、HER2成為了一個重要治療靶點。目前針對HER2的分子靶向藥物如曲妥珠單抗、帕妥珠單抗等已應(yīng)用于乳腺癌的臨床治療,但其單獨應(yīng)用的有效率不高且存在耐藥問題,提示在HER2過表達的乳腺癌中仍有未知的信號分子調(diào)節(jié)HER2信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),對乳腺癌的發(fā)生具有重要影響。
細(xì)絲蛋白A(FilaminA,F(xiàn)LNa)又稱肌動蛋白結(jié)合蛋白280(actin-bindingprotein280,ABP-280),分子量280kDa,由Stossel
6、等首次發(fā)現(xiàn)于非肌肉組織的肌動蛋白細(xì)絲交聯(lián)蛋白中。全長的FLNa主要定位于細(xì)胞質(zhì),容易發(fā)生蛋白分解。其90kDa的裂解片段可以定位于細(xì)胞核。FLNa是“V”形的同型二聚體,由肌動蛋白結(jié)合區(qū)、24個重復(fù)的β-折疊片層和2個絞鏈區(qū)組成。FLNa的特殊結(jié)構(gòu)決定其具有強大的功能:FLNa分子可交聯(lián)肌動蛋白絲形成穩(wěn)定的細(xì)胞骨架,并與多種細(xì)胞膜蛋白結(jié)合,調(diào)節(jié)如MAPK/ERK、PI3K/Akt等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,最終影響腫瘤細(xì)胞的增殖、粘附、遷
7、移和侵襲等生物學(xué)行為。Zhu等認(rèn)為FLNa可以調(diào)控人惡性黑色素瘤細(xì)胞EGFR的活化,EGFR與HER2屬同一家族,而FLNa能否參與HER2陽性乳腺癌細(xì)胞的活化目前并無相關(guān)報道。
本研究擬通過:(1)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立下調(diào)FLNa的HER2陽性乳腺癌MDA-MB-453穩(wěn)定細(xì)胞株;(2)采用MTS法、劃痕修復(fù)實驗、Transwell法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲能力;(3)采用Westernblot法,檢測HER2及其
8、下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中各激酶的活化水平。意在從細(xì)胞、分子水平探討FLNa對HER2陽性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453增殖、遷移和侵襲的調(diào)節(jié)機制,研究FLNa下調(diào)對HER2活化及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響,為更精準(zhǔn)地治療HER2陽性乳腺癌提供有效的靶點。
方法:
1、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建下調(diào)FLNa的穩(wěn)定細(xì)胞株
將FLNashRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人HER2陽性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453中,經(jīng)嘌呤霉素篩選,獲得下調(diào)FLNa的
9、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(MDA-MB-453/KD)及其對照組細(xì)胞株(MDA-MB-453/Ctrl);利用Westernblot檢測其中FLNa的蛋白水平。
2、MTS法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的增殖能力
將MDA-MB-453/KD及MDA-MB-453/Ctrl細(xì)胞消化后各自接種到96孔板中,饑餓培養(yǎng)4h后,予不同濃度EGF(0nM、4nM、20nM、100nM)分別刺激培養(yǎng)48h,加入MTS,酶標(biāo)儀上檢測各孔的OD值。通過
10、比較各組之間的差別來測定細(xì)胞的增殖情況。
3、通過劃痕修復(fù)實驗來檢測MDA-MB-453細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后的遷移情況
將MDA-MB-453/KD及MDA-MB-453/Ctrl細(xì)胞各自接種于24孔板,饑餓培養(yǎng)4h后,用10ul槍頭在底部劃痕。兩組細(xì)胞均分為無EGF刺激組和20nMEGF刺激組;置于顯微鏡下觀察劃痕修復(fù)情況,定時進行拍照,直至劃痕愈合。
4、Transwell實驗測定MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染后
11、的侵襲情況
將基質(zhì)膠鋪于Transwell小室的上室,MDA-MB-453/KD及MDA-MB-453/Ctrl兩組細(xì)胞消化后分別鋪于小室上室,在無FBS的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),下室放入含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液中,培養(yǎng)6天后;取出小室,用95%冰乙醇固定、HE染色,顯微鏡下拍照并計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。
5、Westernblot檢測HER2活化水平及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子的變化
將MDA-MB-453/KD
12、及MDA-MB-453/Ctrl細(xì)胞分別接種于35mm培養(yǎng)皿,無胎牛血清的1640培養(yǎng)基饑餓4h,經(jīng)20nMEGF刺激后,于不同時間(0min、5min、10min、30min)收集細(xì)胞,提取總蛋白;采用Westernblot檢測FLNa、p-HER2、HER2、p-Akt、Akt、p-ERK及ERK的水平,以?-actin作為內(nèi)參蛋白。
結(jié)果:
1、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中FLNa蛋白表達水平的檢測
采用Weste
13、rnblot檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中FLNa蛋白的表達水平,實驗結(jié)果如下,MDA-MB-453/KD細(xì)胞FLNa的相對表達量(0.60±0.05)明顯少于MDA-MB-453/Ctrl細(xì)胞(1.05±0.01),具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。
2、檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力
2.1MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的增殖能力
采用MTS法檢測MDA-MB-453細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)后的增殖情況:各濃度EGF(0nM、
14、4nM、20nM、100nM)刺激的MDA-MB-453/KD組細(xì)胞的OD值(1.26±0.03,1.39±0.01,1.55±0.02,1.82±0.04)明顯高于MDA-MB-453/Ctrl組(0.88±0.02,0.98±0.03,1.07±0.14,1.38±0.09),具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。
2.2MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的遷移能力
采用Woundhealing實驗測定MDA-MB-453
15、穩(wěn)轉(zhuǎn)株的遷移情況:無EGF刺激時,MDA-MB-453/KD細(xì)胞在不同時間點的遷移率(23.06±0.14%,23.26±0.14%,39.62±0.04%,47.16±0.16%)均明顯高于MDA-MB-453/Ctrl組(7.85±1.08%,7.85±1.87%,12.15±0.53%,20.93±1.39%),具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01);給予20nMEGF刺激時,MDA-MB-453/KD組細(xì)胞不同時間點的遷移率(30.16
16、±0.62%,36.59±0.77%,42.87±1.53%,50.00±0.00%)亦明顯高于MDA-MB-453/Ctrl組(13.34±0.51%,14.38±1.18%,15.80±1.56%,25.65±0.43%),有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。
2.3MDA-MB-453穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的侵襲能力
采用Transwell實驗檢測MDA-MB-453穩(wěn)轉(zhuǎn)株的侵襲情況:MDA-MB-453/KD組平均穿膜細(xì)胞數(shù)(
17、3±0.23)明顯高于MDA-MB-453/Ctrl組(14±0.44),具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。
3、MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HER-2活化水平及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子的變化
采用Westernblot實驗測定MDA-MB-453穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞在20nMEGF刺激0min、5min、10min、30min后各蛋白的表達水平:MDA-MB-453/KD組FLNa的表達量(0.22±0.02,0.25±0.03
18、,0.22±0.02,0.23±0.04)均明顯低于MDA-MB-453/Ctrl組(0.82±0.03,0.83±0.03,0.82±0.03,0.84±0.03),均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01);經(jīng)EGF刺激5min、10min、30min后p-HER2的水平(0.83±0.02,0.71±0.05,0.59±0.03)均明顯高于Ctrl組(0.42±0.05,0.17±0.01,0.07±0.03),均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)
19、;p-Akt的水平(0.84±0.05,0.63±0.04,0.46±0.03)均明顯高于Ctrl組(0.44±0.03,0.24±0.03,0.06±0.02),均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01);p-ERK的水平(0.83±0.02,0.86±0.02,0.79±0.02)均明顯高于Ctrl組(0.44±0.04,0.27±0.04,0.17±0.03),均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。
結(jié)論:
1、下調(diào)FLNa的表
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