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簡(jiǎn)介：目的構(gòu)建人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子HUMANVULARENDOTHELIALGROWTHFACT，HVEGF165腺相關(guān)病毒ADENOASSOCIATEDVIRUS，AAV載體AAVHVEGF165，并體外檢測(cè)其在椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞中的表達(dá)，以及觀察AAVHVEGF165與AAVTGFΒ1TRANSFMINGGROWTHFACTBETA1，TGFΒ1基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞Ⅰ型膠原的生物學(xué)效應(yīng)。探討應(yīng)用HVEGF165基因逆轉(zhuǎn)椎間盤退變可行性。方法采用分子克隆技術(shù)，從PCDNA3HVEGF165質(zhì)粒獲得HVEGF165CDNA，并克隆至AAV包裝質(zhì)粒PSNAV上，構(gòu)建成PSNAVHVEGF165的AAV重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定正確，用脂質(zhì)體介導(dǎo)PSNAVHVEGF165轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞VEC，熒光免疫組化方法檢測(cè)HVEGF165蛋白，并用MTT法測(cè)定HVEGF165對(duì)VEC增殖的影響。由本元正陽公司對(duì)鑒定正確的PSNAVHVEGF165進(jìn)行AAVHVEGF165的包裝。AAVHVEGF165與AAVTGFΒ1聯(lián)合轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞，WESTERNBLOTTING檢測(cè)HVEGF165與TGFΒ1的表達(dá)以及纖維環(huán)細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)量的變化。結(jié)論構(gòu)建的腺相關(guān)病毒載體AAVHVEGF165可在體外表達(dá)，HVEGF165在體外能夠協(xié)同TGFΒ1促進(jìn)纖維環(huán)細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)的增加，HVEGF165有可能基因逆轉(zhuǎn)椎間盤的早期退變。

簡(jiǎn)介：腫瘤、創(chuàng)傷、感染、先天性疾病、骨髓炎手術(shù)清創(chuàng)等導(dǎo)致的骨缺損以及軟骨缺損是臨床上的常見病，骨組織工程的實(shí)驗(yàn)研究為臨床上的骨缺損及軟骨缺損的治療提供了新的思路，骨髓源性干細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新能力及很好的可塑性，可以向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、少突樹突細(xì)胞、肌細(xì)胞等細(xì)胞分化，但骨髓源性干細(xì)胞在人體的存在數(shù)量有限，取材時(shí)對(duì)患者造成的痛苦較大，成本也較高，一時(shí)間成為骨組織工程修復(fù)骨缺損及軟骨缺損發(fā)展的瓶頸。2001年ZUK等1人在人體的脂肪懸液中分離出了干細(xì)胞，這些脂肪源性干細(xì)胞23和骨髓源性干細(xì)胞具有相似的生物學(xué)特性，同樣可以向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、少突樹突細(xì)胞、肌細(xì)胞等細(xì)胞分化，況且脂肪源性干細(xì)胞來源廣泛、取材較容易、對(duì)患者造成的痛苦也較小，可以作為修復(fù)骨缺損、軟骨缺損理想的種子細(xì)胞，成為近年來研究的熱點(diǎn)。目的1分離兔脂肪源性干細(xì)胞。2研究脂肪源性干細(xì)胞最佳的生長(zhǎng)條件及生物學(xué)特性。3經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)脂肪源性干細(xì)胞CD29、CD34、CD44、CD45的陽性率。4繪制脂肪源性干細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。5研究兔脂肪源性干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)條件下的成骨誘導(dǎo)潛能，并用GOMI萘酚磷酸酯法染色及VONKOSSA染色，檢驗(yàn)成骨誘導(dǎo)結(jié)果。6研究兔脂肪源性干細(xì)胞在成軟骨誘導(dǎo)條件下的成軟骨誘導(dǎo)潛能4，并用阿利新蘭染色及番紅花亮綠染色，檢驗(yàn)成軟骨誘導(dǎo)結(jié)果。7篩選成軟骨分化相關(guān)的MIRNA，分析成軟骨分化過程中相關(guān)的MIRNA在脂肪源性干細(xì)胞成軟骨分化過程中的表達(dá)模式。方法1脂肪源性干細(xì)胞的分離用水合氯醛對(duì)兔行腹腔注射麻醉，備皮、消毒、鋪巾，無菌操作下沿腹部中線旁2CM處剪開約5CM大小切口，暴露其皮下白色脂肪組織，剪去表層筋膜及小血管，用PBS緩沖液洗滌，移入安瓿瓶，在超凈工作臺(tái)中用眼科剪剪碎成糊狀，加入2倍體積01％I型膠原酶，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱消化60MIN，消化完成后加入等體積含10％胎牛血清的DMEMF12終止消化，200目篩網(wǎng)過濾，1000RMIN離心10MIN，去上清，加入含10％FBS的DMEMF12培養(yǎng)液，輕柔吹打均勻，接種于25CM2的培養(yǎng)瓶中，置入37℃，5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3D換液1次，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)，待細(xì)胞融合約80％時(shí)去除培養(yǎng)液，加入適量025％胰蛋白酶消化，按1∶2傳代培養(yǎng)。2脂肪源性干細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)用胰酶消化法收集第5代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，調(diào)整密度為109L取CD29PE，CD34PE，CD44PE，CD45PE單克隆抗體各5UL，細(xì)胞懸液100ΜL，混勻后避光孵育15MIN，加PBS500ΜL重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。3繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線取第3、5、10、15代ADSCS，密度調(diào)整為1107個(gè)L，接種于96孔板，每孔200ΜL，各代4個(gè)復(fù)孔。每日取1板，每孔加入5GLMTT20ΜL，37℃孵育5H，加DMSO150ΜL，輕輕震蕩10MIN，酶標(biāo)儀490NM波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A值，連測(cè)9D，以細(xì)胞吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，時(shí)間D為橫坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。4脂肪源性干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化當(dāng)原代細(xì)胞傳代至第3代并覆蓋瓶底約80％時(shí)，消化瓶底細(xì)胞并收集，接種于6孔板中，3孔為實(shí)驗(yàn)組，剩余3孔為對(duì)照組，24H后更換為含DMEMF12，10％FBS，01ΜMOLL地塞米松，50ΜGML抗壞血酸，10MMOLLΒ甘油磷酸鈉的成骨誘導(dǎo)液，對(duì)照組加入普通培養(yǎng)液，誘導(dǎo)2周后取細(xì)胞爬片進(jìn)行GOMI萘酚磷酸酯法與VONKOSSA染色，定期倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍攝記錄。5脂肪源性干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化當(dāng)脂肪源性干細(xì)胞的原代細(xì)胞傳至第3代并覆蓋瓶底約80％時(shí)，消化瓶底細(xì)胞并收集，接種于6孔板中，3孔為實(shí)驗(yàn)組，剩余3孔為對(duì)照組，24H后更換為含DMEMF12，01ΜMOLL地塞米松，50ΜGML維生素C，10NGMLTGFΒ1，625ΜGML胰島素，625ΜGML轉(zhuǎn)鐵蛋白成軟骨誘導(dǎo)液，對(duì)照組加入普通培養(yǎng)液，誘導(dǎo)2周后取細(xì)胞爬片行阿利新蘭染色及番紅花亮綠染色，定期倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍攝記錄。6基因芯片篩選成軟骨相關(guān)MIRNA從兔腹部皮下脂肪組織中分離、培養(yǎng)脂肪源性干細(xì)胞。應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選脂肪源性干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)前后表達(dá)差異顯著的MIRNA，采用RTPCR技術(shù)檢測(cè)差異顯著的MIRNA，在成軟骨誘導(dǎo)第7天、第14天、第21天上調(diào)和下調(diào)相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度，以ELISA試劑盒檢測(cè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)成軟骨相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果1脂肪源性干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察6H后原代細(xì)胞大部分貼壁，呈圓形、短梭形或多角形，分布均勻，至36H大部分細(xì)胞成長(zhǎng)梭形，細(xì)胞體積明顯增大，胞質(zhì)內(nèi)有明顯顆粒，72H后換液繼續(xù)培養(yǎng)，至第7天達(dá)80％融合，用胰蛋白酶?jìng)鞔囵B(yǎng)，24H后呈纖維樣形態(tài)，漩渦狀、輻射狀或平行樣排列，分布均勻，3～4D達(dá)80％融合。隨傳代次數(shù)增加，細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，傳代細(xì)胞較原代細(xì)胞明顯增大。2脂肪源性干細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示不同代數(shù)細(xì)胞表型檢測(cè)結(jié)果CD29、CD44均高表達(dá)，陽性率均在95％以上，且隨代數(shù)增加而無明顯下降趨勢(shì)，CD34、CD45呈低表達(dá)，陽性率均低于5％。3脂肪源性干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示第3、5、10、15代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線無明顯差異，均成“S”形，約4天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，約6天達(dá)峰值，隨代數(shù)增加生長(zhǎng)曲線無明顯變化。4脂肪源性干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化鑒定取第2、4、6、8代細(xì)胞用成骨誘導(dǎo)液分化后分別用GOMI萘酚磷酸酯法染色ALP染色、VONKOSSA染色。隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，ALP染色表現(xiàn)為堿性磷酸酶陽性的細(xì)胞逐漸增多，多表現(xiàn)為棕褐色顆粒，VONKOSSA法礦化結(jié)節(jié)染色見鈣結(jié)節(jié)呈黑色，表現(xiàn)為VONKOSSA陽性，而加入普通培養(yǎng)基的對(duì)照組均為陰性表現(xiàn)。5脂肪源性干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化鑒定取第2、4、6、8代細(xì)胞用成軟骨誘導(dǎo)液分化后分別用阿利新蘭染色及番紅花亮綠染色，隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，阿利新蘭染色后誘導(dǎo)細(xì)胞成藍(lán)色，呈阿利新蘭染色陽性番紅花亮綠染色后誘導(dǎo)細(xì)胞成紅色，無綠色，呈番紅花亮綠染色陽性。6成軟骨誘導(dǎo)前后MIRNA基因芯片篩選結(jié)果脂肪源性干細(xì)胞在傳至第4代后可獲得均一性較高的脂肪源性干細(xì)胞基因芯片技術(shù)篩選出成軟骨分化前后表達(dá)差異明顯的10個(gè)MIRNA，其中6個(gè)上調(diào)，4個(gè)下調(diào)成軟骨相關(guān)蛋白Ⅱ型膠原、X型膠原、AGGRECAN的質(zhì)量濃度在成軟骨分化第7天明顯升高，第14天達(dá)峰值，第21天略有下降。結(jié)論脂肪源性干細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示不同代數(shù)細(xì)胞表型檢測(cè)結(jié)果CD29、CD44均高表達(dá)，陽性率均在90％以上，且隨代數(shù)增加而無明顯下降趨勢(shì)，CD34、CD45呈低表達(dá)，陽性率均低于10％，其中CD29在血管發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，CD44在新生細(xì)胞外基質(zhì)生成過程中起重要作用，這種檢測(cè)結(jié)果和骨髓源性干細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果一致，說明在細(xì)胞表面分子表達(dá)上脂肪源性干細(xì)胞和骨髓源性干細(xì)胞具有很相似的共性。繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示第3、5、10、15代脂肪源性干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線無明顯差異，均成“S”形，約4天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，約6天達(dá)峰值，隨代數(shù)增加生長(zhǎng)曲線無明顯變化，說明脂肪源性干細(xì)胞的增值特點(diǎn)較穩(wěn)定，可多次重復(fù)利用。6H后原代細(xì)胞大部分貼壁，呈圓形、短梭形或多角形，分布均勻，至36H大部分細(xì)胞成長(zhǎng)梭形，細(xì)胞體積明顯增大，胞質(zhì)內(nèi)有明顯顆粒，72H后換液繼續(xù)培養(yǎng)，至第7天達(dá)80％融合，用胰蛋白酶?jìng)鞔囵B(yǎng)，24H后呈纖維樣形態(tài)，漩渦狀、輻射狀或平行樣排列，分布均勻，3～4D達(dá)80％融合。隨傳代次數(shù)增加，細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，傳代細(xì)胞較原代細(xì)胞明顯增大，多次培養(yǎng)的脂肪源性干細(xì)胞生物學(xué)特性較穩(wěn)定，易于分離和培養(yǎng)，經(jīng)液氮冷凍保存及復(fù)蘇后，生物學(xué)特性無明顯變化。本實(shí)驗(yàn)證明了脂肪源性干細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下具有向成骨分化的潛能，傳代后各項(xiàng)生物特性指標(biāo)無明顯下降，生物性能穩(wěn)定，切取材方便、創(chuàng)傷小，可作為修復(fù)骨缺損的理想的種子細(xì)胞。脂肪源性干細(xì)胞在成軟骨誘導(dǎo)條件下，分別用阿利新蘭染色及番紅花亮綠染色，均呈陽性表達(dá)，有酸性粘多糖的分泌，而軟骨細(xì)胞的主要功能就是分泌酸性粘多糖和膠原蛋白，本實(shí)驗(yàn)隨時(shí)間的延長(zhǎng)，染色結(jié)果有加重的趨勢(shì)，分泌酸性粘多糖和膠原蛋白的含量有增加的趨勢(shì)，證明了脂肪源性干細(xì)胞在成軟骨誘導(dǎo)條件下具有成軟骨分化的潛能，可以作為修復(fù)軟骨缺損的理想種子細(xì)胞。

簡(jiǎn)介：立題依據(jù)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎R(shí)HEUMATOIDARTHRITIS，RA，簡(jiǎn)稱類風(fēng)關(guān)是常見的、慢性致殘性自身免疫性疾病之一。疾病的病因目前尚不清楚，可能的起始因子觸發(fā)了炎癥反應(yīng)，促使膜磷脂分解為花生四烯酸，在環(huán)氧化酶CYCLOOXYGENASE，COX等一系列酶的催化作用下，合成前炎癥介質(zhì)前列腺素E2PROSTAGLINE2，PGE2和細(xì)胞因子如白介素1ΒINTERLEUKIN1，IL1、白介素6INTERLEUKIN6，IL6和腫瘤壞死因子ΑTUMOUSNECROSISFACTΑ，TNFΑ等，后者通過多種途徑促進(jìn)關(guān)節(jié)炎癥持續(xù)進(jìn)展和關(guān)節(jié)的破壞。COX是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素過程中的限速酶，有研究證實(shí)類風(fēng)關(guān)患者滑膜組織COX2表達(dá)顯著增加，它的活性高低直接關(guān)系到組織中前列腺素合成的量，在關(guān)節(jié)炎癥中最為重要的是PGE2。PGE2具有多種生物學(xué)功能，參與促進(jìn)關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，增加了MMPMATRIXMETALLOPROTEINASE，基質(zhì)金屬蛋白酶的合成和誘導(dǎo)軟骨的降解。COX2和PGE2在促進(jìn)VEGF生成和關(guān)節(jié)滑膜新生血管形成中起著關(guān)鍵的作用。因此，本研究試圖尋找有效的小分子干擾RNASIRNA，SMALLINTERFERINGRNA應(yīng)用RNA干擾技術(shù)RNAI，RNAINTERFERING來特異性地抑制人類風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞COX2HCOX2，HUMANCOX2基因的表達(dá)，同時(shí)在細(xì)胞水平探討HCOX2基因的生物學(xué)功能，初步探討抑制類風(fēng)關(guān)炎癥進(jìn)展和關(guān)節(jié)破壞的新途徑。主要研究目的篩選和體外合成HCOX2SIRNA，并轉(zhuǎn)染入人類風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞，旨在篩選出并合成能夠特異性阻斷人類風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞HCOX2生成的SIRNA。次要研究目的進(jìn)一步分析特異性地阻斷人類風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞HCOX2合成的SIRNA對(duì)前炎癥介質(zhì)PGE2和致炎癥性細(xì)胞因子IL1Β、IL6、TNFΑ合成的作用，了解其對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VULARENDOTHELIALGROWTHFACT，VEGF合成的影響；觀察HCOX2SIRNA對(duì)人類風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。研究方法實(shí)驗(yàn)的滑膜組織取之于行滑膜切除術(shù)的類風(fēng)關(guān)患者符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂的類風(fēng)關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。通過分離、消化、培養(yǎng)和傳代滑膜成纖維細(xì)胞，液氮凍存。獲取人COX2MRNA序列，設(shè)計(jì)和合成4條針對(duì)COX2MRNASIRNA1＃4＃SIRNA，1條隨機(jī)序列作為對(duì)照。分成AH組，A組為未轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照；BF組處理依次為隨機(jī)SIRNANC、1＃SIRNA、2＃SIRNA、3＃SIRNA、4＃SIRNA，GH組為NS398COX2選擇性抑制劑濃度100ΜMOLL和濃度500ΜMOLL處理。另設(shè)立HELA細(xì)胞為陽性對(duì)照。將復(fù)蘇后的人類風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞滴加于6孔板中，應(yīng)用LIPOFECTAMINE2000轉(zhuǎn)染，4小時(shí)后，各培養(yǎng)孔加入終濃度為200NMOLL的佛波酯PMA。分別在轉(zhuǎn)染36H和48H后收集滑膜細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)和總RNA，應(yīng)用半定量的RTPCR檢測(cè)HCOX2MRNA表達(dá)水平，通過WESTERNBLOT檢測(cè)HCOX2蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)HCOX2下游產(chǎn)物PGE2的水平。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子IL1Β、IL6和TNFΑ的水平。檢測(cè)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液VEGF水平。比較COX2表達(dá)水平和細(xì)胞因子水平之間相關(guān)性。觀察各組成纖維細(xì)胞形態(tài)和通過臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞死亡數(shù)目。采用Χ2檢驗(yàn)比較未處理陰性對(duì)照組CTL與不同處理組之間以及不同處理組之間細(xì)胞死亡率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有無差別。結(jié)果1RTPCR檢測(cè)各組人滑膜成纖維細(xì)胞HCOX2MRNA水平轉(zhuǎn)染48H后，與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組CTL、隨機(jī)序列對(duì)照組NC、陽性對(duì)照HELA細(xì)胞組條帶相比，4＃SIRNA有明顯的抑制效果。通過應(yīng)用GELWK軟件對(duì)各組凝膠密度掃描，在內(nèi)參照豐度基本相等的前提下，以CTL組為對(duì)照，NC、1＃SIRNA、2＃RNA、3＃RNA、4＃SIRN、陽性對(duì)照HELA細(xì)胞組與CTL組條帶密度比值分別為072、03、025、04、004、21。NC、1＃SIRNA、2＃RNA、3＃RNA、4＃SIRN、100ΜMOLLNS398、500ΜMOLLNS398各組與CTL組HCOX2MRNA條帶密度比值分別為071、019、016、025、004、205和063，提示4＃SIRNA干擾COX2MRNA表達(dá)的效率明顯高于陰性對(duì)照組、其他SIRNA組，也優(yōu)于100ΜMOLLNS398和500ΜMOLLNS398。2WESTERN檢測(cè)各組人滑膜成纖維細(xì)胞HCOX2蛋白表達(dá)的水平轉(zhuǎn)染36H后，與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組CTL、隨機(jī)序列對(duì)照組NC、陽性對(duì)照HELA細(xì)胞組相比，1＃SIRNA、2＃SIRNA、3＃SIRNA組無明顯的抑制效果，4＃SIRNA組抑制效果明顯。采用GELWK軟件對(duì)各組條帶行凝膠密度掃描，在內(nèi)參照ACTINMRNA豐度基本相等的前提下，NC、1＃SIRNA、2＃RNA、3＃RNA、4＃SIRN、HELA細(xì)胞組與CTL組HCOX2蛋白密度比值分別為104、052、039、09、0和248，提示4＃SIRNA干擾COX2蛋白表達(dá)效率明顯優(yōu)于未處理組和其他SIRNA組；轉(zhuǎn)染48H后，4＃SIRNA組條帶明顯較其他組條帶色淡，NC、1＃SIRNA、2＃RNA、3＃RNA、4＃SIRN、HELA細(xì)胞組與CTL組HCOX2蛋白條帶密度比值分別為105、052、051、09、015，此結(jié)果與PCR一致。提示4＃SIRNA能顯著抑制人類風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞HCOX2蛋白表達(dá)。3人滑膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液PGE2水平的測(cè)定在轉(zhuǎn)染后24H、36H和48H，4＃SIRNA組滑膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液PGE2水平均較其他各組為低，且在轉(zhuǎn)染后第24H至36H之間下降幅度最為明顯。4＃SIRNA組在轉(zhuǎn)染24H、36H、48H后也較100ΜMOLLNS398組水平低，與500ΜMOLLNS398組水平相近。4人滑膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL1Β、IL6、TNFΑ和VEGF水平的測(cè)定4＃SIRNA組致炎癥細(xì)胞因子IL1Β、TNFΑ、IL6和VEGF下降水平較CTL、隨機(jī)序列對(duì)照組、其他SIRNA組為低；與100ΜMOLLNS398組比較，在24H、36H下降顯著，與500ΜMOLLNS398組趨勢(shì)相類似和水平相接近，但在48H時(shí)略高于500ΜMOLLNS398組。5SIRNA對(duì)人類風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞HCOX2MRNA表達(dá)與培養(yǎng)上清液PGE2、IL1Β、TNFΑ、VEGF水平相關(guān)性影響在轉(zhuǎn)染24H時(shí)，TNFΑ水平和HCOX2表達(dá)無相關(guān)性外，不同SIRNA處理組分別在24H、36H、48H時(shí)，隨著COX2MRNA表達(dá)水平下降，滑膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液PGE2、IL1Β、TNFΑ、VEGF水平也隨之明顯下降。提示SIRNA不同處理組COX2MRNA表達(dá)水平分別與PGE2、IL1Β、TNFΑ、VEGF水平呈平行關(guān)系。6干擾COX2表達(dá)后對(duì)人類風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)影響不同SIRNA處理組成纖維細(xì)胞死亡率在9﹪～11﹪，各組與CTL組相比死亡細(xì)胞數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯差別P值均大于005。4＃SIRNA組與其他SIRNA處理組在死亡細(xì)胞數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯差別P值均大于005。與500ΜMOLLNS398組比較，4＃SIRNA組細(xì)胞死亡率與之相近11﹪，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯差別P值均大于005。各組在外觀形態(tài)學(xué)上無明顯差別，提示RNAI對(duì)人滑膜成纖維細(xì)胞毒性沒有明顯增加，4＃SIRNA較其他SIRNA有效地抑制HCOX2表達(dá)的同時(shí)，其成纖維細(xì)胞死亡細(xì)胞數(shù)并未較其他組增加。結(jié)論4＃SIRNA針對(duì)COX2MRNA靶序列CGTTCGACTGAACTGTAGA能有效地抑制人類風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞COX2MRNA表達(dá)和COX2蛋白的合成，且同時(shí)抑制其合成PGE2和炎癥細(xì)胞因子IL1Β、IL6、TNFΑ及VEGF，SIRNA不同處理組COX2MRNA表達(dá)水平與IL6水平呈平行關(guān)系。SIRNA干擾COX2合成后對(duì)人類風(fēng)關(guān)滑膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)無影響。

簡(jiǎn)介：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文纖維連接蛋白誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞的生物學(xué)特性和殺瘤活性的實(shí)驗(yàn)研究姓名杜微麗申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師王士勇20090401952％，P0042。對(duì)CD3十CD4細(xì)胞輔助性T淋巴細(xì)胞和CD3CDL6CD56細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞中的主要效應(yīng)細(xì)胞的影響A組與B組無差別，P01。主要效應(yīng)細(xì)胞CD3CDL6CD56細(xì)胞絕對(duì)數(shù)擴(kuò)增倍數(shù)兩組分別為3778倍和2069倍。培養(yǎng)第15天時(shí)各組細(xì)胞存活率均在95％以上，分別為9771107％、9548201％，P005。培養(yǎng)第15天的細(xì)胞對(duì)HELA、K562、A549、GM823等瘤株的體外細(xì)胞毒試驗(yàn)，201和401兩個(gè)效靶比殺傷率分別為A組324775L％和5515843％HELA，4843815％和65754839％K562，58584852％和657341479％A549，67541837％和74281571％G823。B組4530士5；16％和6543491％HELA，4716士613％和62904725％K562，70841123％和834441376％A549，75104724％和886士1228％G823。A組與B組無差別，尸值005。新方法誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞分泌較高水平的I呻、顆粒酶B、穿孔素等殺瘤效應(yīng)分子，分泌低水平的IL4。結(jié)論當(dāng)日F匕新培養(yǎng)方法促細(xì)胞增殖能力強(qiáng)；未改變CIK細(xì)胞的屬性；CD3CD8十殺傷性T細(xì)胞比例顯著增多；培養(yǎng)后的效應(yīng)細(xì)胞激活后所分泌的細(xì)胞因子IFN吖明顯增高。IL4水平無變化。顆粒酶B、穿孔素呈陽性。體外細(xì)胞毒活性與傳統(tǒng)方法相當(dāng)，可以替代傳統(tǒng)方法。關(guān)鍵詞纖維連接蛋白；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)；MTT2

簡(jiǎn)介：博士學(xué)位論文半側(cè)顏面發(fā)育不全患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞半側(cè)顏面發(fā)育不全患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為及免疫調(diào)控能力的研究生物學(xué)行為及免疫調(diào)控能力的研究王茜培養(yǎng)類別全日制學(xué)位類型學(xué)術(shù)學(xué)位一級(jí)學(xué)科專業(yè)類口腔醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科專業(yè)口腔臨床醫(yī)學(xué)（正畸）研究方向遺傳病與顱頜面畸形指導(dǎo)教師丁寅教授（主任醫(yī)師）金巖教授（主任醫(yī)師）培養(yǎng)單位口腔醫(yī)院口腔正畸科二O一三年五月分類號(hào)R7835UDC61631密級(jí)公開第四軍醫(yī)大學(xué)THEFOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文目錄縮略語表1中文摘要3英文摘要6前言10文獻(xiàn)回顧12正文25第一部分HFM患者的收集、臨床檢查及分析251材料252方法263結(jié)果304討論36第二部分HFM患者HBMMSCS生物學(xué)行為的實(shí)驗(yàn)研究381材料392方法403結(jié)果504討論58第三部分HFM患者HBMMSCS免疫調(diào)節(jié)功能研究601材料602方法603結(jié)果654討論67小結(jié)69參考文獻(xiàn)70個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果81致謝82臨床病例報(bào)告84

簡(jiǎn)介：燒傷患者在治療過程中將面臨很多復(fù)雜問題，其中最核心的問題始終是燒傷的創(chuàng)面愈合。創(chuàng)面修復(fù)過程中，創(chuàng)面換藥必不可少。理論上，應(yīng)用創(chuàng)面外用藥物的目的是為了更好的促進(jìn)創(chuàng)面愈合，只是側(cè)重點(diǎn)不同而已。在創(chuàng)面愈合的復(fù)雜機(jī)制中，成纖維細(xì)胞與表皮細(xì)胞的增殖和遷移是兩個(gè)重要方面。成纖維細(xì)胞是構(gòu)成肉芽組織的主要成分之一，可以合成和分泌膠原、纖維連接蛋白、透明質(zhì)酸等細(xì)胞外基質(zhì)，也可以分泌多種細(xì)胞因子參與創(chuàng)面愈合；表皮細(xì)胞的遷移、增殖、分化決定著創(chuàng)面再上皮化。目前臨床外用藥物種類、劑型繁多，外用藥物的選擇不夠規(guī)范，一定程度上影響了臨床治療效果。為了進(jìn)一步探索創(chuàng)面外用藥物和RHGH對(duì)成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞增殖的影響以及他們對(duì)成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞的劑量效應(yīng)關(guān)系，用不同種類、濃度的創(chuàng)面外用藥物作用于體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞、HACAT，觀察這些細(xì)胞的生物學(xué)特性改變，為臨床外用藥物的合理選擇提供間接的理論依據(jù)。目的1、建立穩(wěn)定的成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)、HACAT傳代培養(yǎng)，應(yīng)用多種不同的創(chuàng)面外用藥物、RHGH對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，觀察它們對(duì)細(xì)胞的影響。2、觀察同一種藥物不同濃度對(duì)細(xì)胞的影響。方法1、培養(yǎng)原代的成纖維細(xì)胞并進(jìn)行穩(wěn)定傳代，對(duì)HACAT細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。2、做成纖維細(xì)胞與HACAT細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)曲線以明確藥物刺激時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞的密度和時(shí)機(jī)。3、不同藥物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行刺激后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、MTT檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖情況以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞周期。4、同一藥物不同濃度作用于培養(yǎng)細(xì)胞后，通過倒置顯微鏡、MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀觀察對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響。結(jié)果成纖維細(xì)胞1、形態(tài)學(xué)觀察對(duì)照組、EGF組、及0160、1600GLRHGH組成纖維細(xì)胞數(shù)目較多，呈長(zhǎng)條形或梭形，輪廓不清，透明度高；丁胺卡那霉素組、慶大霉素組、氯霉素組、磺胺米隆組細(xì)胞數(shù)目較少，形態(tài)不規(guī)則，輪廓清晰，透明度低，細(xì)胞內(nèi)多有顆粒樣物質(zhì)及空泡。BFGF組、0016GLRHGH組細(xì)胞分布均勻、密集，呈長(zhǎng)條形或梭形，核分裂相多見，輪廓不清，透明度高。2、MTT法檢測(cè)與對(duì)照組吸光度OD值比較，各種劑量丁胺卡那霉素組、慶大霉素組、氯霉素組、磺胺米隆組成纖維細(xì)胞OD值均明顯降低P＜005或001。其中氯霉素組存在組內(nèi)差異，低濃度組OD值較中、高濃度組高P＜005。EGF組、及0160、1600GLRHGH組OD值與對(duì)照組接近P＞005。3、細(xì)胞周期檢測(cè)與對(duì)照組細(xì)胞增殖指數(shù)PI比較，0210MGL組丁胺卡那霉素組及0160、1600GLRHGH組PI值無明顯變化P＞005而EGF組、BFGF組及0016RHGH組BFGF組PI值明顯升高P＜005。HACAT細(xì)胞結(jié)果1、形態(tài)學(xué)觀察對(duì)照組、慶大霉素組、BFGF組、丁胺卡那霉素0021UGML組HACAT數(shù)目較多，呈長(zhǎng)條形或梭形，輪廓不清，透明度高；丁胺卡那霉素021UGML、21UGML組、氯霉素組、磺胺米隆組、EGF組細(xì)胞數(shù)目較少，形態(tài)不規(guī)則，輪廓清晰，透明度低，細(xì)胞內(nèi)多有顆粒樣物質(zhì)及空泡。RHGH組細(xì)胞分布均勻、密集，呈長(zhǎng)條形或梭形，核分裂相多見，輪廓不清，透明度高。2、MTT法檢測(cè)與對(duì)照組吸光度OD值比較，除慶大霉素組、丁胺卡那霉素0021UGML組、BFGF組無變化外P＞005，其余各種劑量抗菌素組及EGF組HACAT細(xì)胞OD值均明顯降低P＜005或001。其中氯霉素組、丁胺卡那霉素組存在組內(nèi)差異，低濃度組OD值較中、高濃度組高P＜005。RHGH組OD值與對(duì)照組比較均增高P＜005，且存在組內(nèi)差異，高濃度組OD值較中、低濃度組低P＜005。3、細(xì)胞周期檢測(cè)與對(duì)照組細(xì)胞增殖指數(shù)PI值比較，BFGF組PI值無明顯變化P＞005，0210MGL丁胺卡那霉素組、EGF組PI值明顯降低P＜005而0160、0016GLRHGH組PI值明顯升高P＜005。結(jié)論1、不同創(chuàng)面外用藥物及RHGH對(duì)成纖維細(xì)胞、HACAT細(xì)胞生物學(xué)特性影響各異。2、適當(dāng)劑量的RHGH可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞、HACAT細(xì)胞增殖而大劑量的RHGH并不能促進(jìn)成纖維細(xì)胞、HACAT細(xì)胞增殖。3、氯霉素組對(duì)成纖維細(xì)胞和HACAT細(xì)胞增殖的抑制作用存在組內(nèi)差異，中、高濃度組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用高于低濃度組。4、丁胺卡那霉素組對(duì)HACAT細(xì)胞增殖的抑制作用存在組內(nèi)差異，中、高濃度組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用高于低濃度組。5、RHGH組對(duì)HACAT細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用存在組內(nèi)差異，低濃度組對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用高于中、高濃度組。

簡(jiǎn)介：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文嗜鉻粒蛋白A的生物學(xué)特性與嗜鉻細(xì)胞瘤診斷的相關(guān)研究姓名馮超申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)泌尿外科學(xué)指導(dǎo)教師李漢忠20080401北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博出學(xué)位畢業(yè)論文】■I1一刖舌嗜鉻粒蛋白ACHROMOGRANINA，CGA屬嗜鉻蛋白家族，存在于所有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞內(nèi)能分泌兒茶酚胺的囊泡中，富含酸性氨基酸，為酸性可溶性蛋白質(zhì)，最初從牛腎上腺髓質(zhì)顆粒中提取，焉發(fā)現(xiàn)廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)和APUD系統(tǒng)中。CDNA序列分析和生化研究表驥CGA由439令氮基酸殘基組成，分子量為48KD。在細(xì)胞中CGA被合成后，在反面高爾基體網(wǎng)中的低PH、高CA2環(huán)境下，構(gòu)象發(fā)生變化；由于與CA2結(jié)合，CGH蛋白暴露更多的疏水性顆粒，在交感神經(jīng)的刺激下，CGA與共儲(chǔ)存的兒茶酚胺一同被分泌到細(xì)胞外質(zhì)中。CGA在細(xì)胞內(nèi)有兩個(gè)主要的生物學(xué)作用1、在高爾基網(wǎng)膜上選擇性調(diào)節(jié)靶肽激素和神經(jīng)遞質(zhì)的聚集；2、促進(jìn)高爾基網(wǎng)的通透性，并參與CA2及兒茶酚膠的代謝。同時(shí)CGA是一些生物活性肽的前體；在IP。信號(hào)通貉中CGA直接與主或受體作用，是王魏受體同第三信使EA2之聞的中介。CGA在多種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的組織和病人的血清中含量都有升高，披作為這些腫瘤的標(biāo)志物。免疫電鏡證實(shí)，C烈表達(dá)與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤顆粒多少有關(guān)。1997年ANGELSEN等研究發(fā)現(xiàn)，CGA存在于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，并且含有CGA腫瘤細(xì)胞的患者具有較高的血清CGA水平。嗜鉻細(xì)胞瘤屬神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，可合成、儲(chǔ)存和釋放CGA。嗜鉻細(xì)胞瘤是由神經(jīng)嵴起源的嗜鉻細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤，腫瘤合成、貯存和釋放大量?jī)翰璺影罚憩F(xiàn)為高兒茶酚胺血癥，可弓|起患者出現(xiàn)嚴(yán)重的心、腦血管并發(fā)癥及代謝紊亂。嗜鉻細(xì)胞瘤占高盤壓病入的005％01箋，占新發(fā)高血壓的00溉，尸檢發(fā)現(xiàn)率約為0。09％0。25％。男女發(fā)病率無明顯差別，可以發(fā)生于任何年齡，多見于30一50歲。嗜鉻細(xì)胞瘸生物學(xué)特性復(fù)雜，腫瘤性質(zhì)有良性與惡性；其數(shù)目有單發(fā)與多發(fā)；其發(fā)生部位有單側(cè)與雙側(cè)、腎上腺與腎上腺外；其血壓類型有陣發(fā)性、持續(xù)性或在持續(xù)性的基礎(chǔ)上再發(fā)生陣發(fā)性加重，或發(fā)生高、低皿壓反復(fù)交替發(fā)作的嵩血壓危象，也有部分患者無高血壓表現(xiàn)；其病史有家族性、散發(fā)性；有合并多內(nèi)分泌腺瘤病MEN或非娩N等。所以在嗜鉻細(xì)脆瘤的診斷中，除確定腫瘤位置、大小、形態(tài)、數(shù)露及與周圍臟器的關(guān)系等定位診凝外，還包括定性診斷，以明確腫瘤內(nèi)分泌功能、良惡性等。嗜鉻細(xì)胞瘤確診后應(yīng)及時(shí)行手術(shù)治療，90％的患者可得到治愈。惡性嗜鉻細(xì)胞癯預(yù)后差，而良惡性嗜鉻細(xì)胞瘤在臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查和內(nèi)分泌檢查上無特異性差別，2

簡(jiǎn)介：山東大學(xué)碩士學(xué)位論文苯妥英鈉對(duì)體外培養(yǎng)的人牙周韌帶細(xì)胞生物學(xué)活性的影響姓名于美嬌申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)口腔臨床醫(yī)學(xué)（口內(nèi)）指導(dǎo)教師楊丕山20070407山東大學(xué)碩士學(xué)位論文苯妥英鈉對(duì)體外培養(yǎng)的人牙周韌帶細(xì)胞生物學(xué)活性的影響專業(yè)研究生導(dǎo)師口腔內(nèi)科學(xué)于美嬌楊丕山教授中文摘要目的；苯妥英鈉PH肋YTOIIL’PHT臨床上一直以系統(tǒng)治療癲癇類疾病、心律不齊以及神經(jīng)系統(tǒng)性疾病為主，且療效肯定。直到SHAP的于1958年首次將苯妥英鈉用于創(chuàng)傷愈合，并且取得積極的效果，其在創(chuàng)傷方面的療效及用藥方式才得到學(xué)者們的關(guān)注口】。目前，已有研究表明苯妥英鈉局部用藥可用于治療褥瘡性潰瘍、靜脈淤積性潰瘍、糖尿病性潰瘍、創(chuàng)傷、燒傷以及麻風(fēng)營(yíng)養(yǎng)不良性潰瘍等【2】。并且也有研究表明，苯妥英納對(duì)動(dòng)物成骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及人正常牙齦成纖維細(xì)胞等的增殖和分化有促進(jìn)作用F3棚。因此，我們一定程度上可推理出苯妥英鈉用于牙周組織再生的可能性。牙周韌帶細(xì)胞11眥鋤PEMDONTALLI弘MEILT∞LLS，HPDLCS作為牙周組織中的主要功能細(xì)胞，具有多向分化潛能，在創(chuàng)傷修復(fù)和組織再生中發(fā)揮重要作用。本研究在體外培養(yǎng)人牙周韌帶細(xì)胞的基礎(chǔ)上，觀察不同濃度苯妥英鈉對(duì)牙周韌帶細(xì)胞生物學(xué)活性的影響，并探討其用于促進(jìn)牙周組織再生的可能性，為進(jìn)一步研究牙周組織再生提供一種新的藥物治療方法以及為后期體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供一定的理論依據(jù)。方法牙周韌帶細(xì)胞來自因正畸需要而拔出的健康前磨牙，將組織塊放入DMBM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，達(dá)匯合點(diǎn)后細(xì)胞傳代，第3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1將牙周韌帶細(xì)胞以2104個(gè)／ML接種于96孔板中，24小時(shí)后分別加入苯妥英鈉O，L，5，20，LOO，500，2500PG，M1，與細(xì)胞共同孵育3～4天后，用MRR法測(cè)增殖活性，用PNPP法測(cè)ALP的活性，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞總蛋白含量。2將牙周韌帶細(xì)胞以5104個(gè)／IILL接種于24孔板中，24小時(shí)后加入礦化液含15％陽S、LONUNOL／L爭(zhēng)甘油磷酸鈉、104姍L／L地塞米松、50MG，L抗壞血酸的DMEM培養(yǎng)液L

簡(jiǎn)介：蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文XIAP、XAF1在胃癌BGC823細(xì)胞株的表達(dá)以及去甲基化對(duì)BGC823細(xì)胞生物學(xué)行為的影響姓名劉瑋申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師張煦20080601原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明本人所呈交的學(xué)位論文，是在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。學(xué)位論文中凡引用他人已經(jīng)發(fā)表或未發(fā)表的成果、數(shù)據(jù)、觀點(diǎn)等，均已明確注明出處。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對(duì)本文的研究成果做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均己在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。論文作者簽名牛匿

簡(jiǎn)介：重慶醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文RNAI沉默F(xiàn)AK基因表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF7細(xì)胞生物學(xué)特性的影響姓名馬杰申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)外科學(xué)（普通外科）指導(dǎo)教師王繼見20090501重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文目的應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建針對(duì)人粘著斑激酶FAK的SIRNA表達(dá)載體，研究RNA干擾FAK的表達(dá)及對(duì)人類乳腺癌MCF7細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。方法根據(jù)GENBANK數(shù)據(jù)庫提供的FAK基因序歹JJGI439874構(gòu)建表達(dá)FAK基因SIIⅢA的重組質(zhì)粒FAKPGENESILSIRNA，并隨機(jī)設(shè)計(jì)一條陰性對(duì)照FAKPGENESILIIK。測(cè)序鑒定后，在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染入人乳腺癌MCF。7細(xì)胞，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，應(yīng)用R1’_PCR和WESTEMBLOT檢測(cè)FAKMIⅢA和蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布，體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定腫瘤細(xì)胞穿透MATRIGEL的能力。結(jié)果1經(jīng)過優(yōu)化細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件，當(dāng)所構(gòu)建的重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體的質(zhì)量體積比為14GG／91轉(zhuǎn)染時(shí)，轉(zhuǎn)染效率較高，可達(dá)60％以上。2RTPCR及WESTERNBLOT結(jié)果轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒FAKPGENESILSIRNA后能使乳腺癌MCF7細(xì)胞株FAKMRNA及蛋白的表達(dá)下調(diào)。干擾組FAKMRNA抑制率為6180％，與陰性對(duì)照組031％比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義正O05；干擾組FAK蛋白抑制率JJ4655％，與陰性對(duì)照組862％EL較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義PO05。3流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期結(jié)果重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48D時(shí)后，轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒FAKPGENESILSIRNA的干擾組MCF一7細(xì)胞增殖指數(shù)為2589026％，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組分別為3796060％、3821056％。與干擾組相比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義PO05；與干擾組相比，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組有更多的細(xì)胞被阻滯于GOG1期。3’

簡(jiǎn)介：冠狀動(dòng)脈疾病（CAD）一直是威脅人類健康的幾大殺手之一，目前最好的治療手段是在病變部位置入藥物洗脫支架（DESS），可一定程度上減少血管再狹窄的幾率。但臨床結(jié)果表明，DESS雖降低了血管再狹窄，卻大大延遲了支架內(nèi)皮化的時(shí)間，治療效果不理想。究其原因，DESS上攜帶的抗增殖類藥物的使用，這類藥物多為紫杉醇及其衍生物等，他們大多無細(xì)胞特異性，在抑制中膜細(xì)胞增殖的同時(shí)；也抑制了內(nèi)膜細(xì)胞的增殖，使損傷的內(nèi)膜未能快速修復(fù)。然而這些藥物延遲內(nèi)皮化的詳細(xì)機(jī)理卻不清楚，特別是如何延遲內(nèi)皮細(xì)胞快速遷移至損傷位點(diǎn)的機(jī)制?；诖?，本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECS為細(xì)胞模型，體外探究紫杉醇的類似物多西他賽（DTX）對(duì)HUVECS的影響及其作用機(jī)制，重點(diǎn)關(guān)注細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移的經(jīng)典信號(hào)通路ROCK是否參與了DTX相關(guān)的HUVECS遷移。試圖揭示DTX延遲內(nèi)皮化的原因，探究快速內(nèi)皮化潛在靶點(diǎn)，且為DTX的臨床應(yīng)用提供更廣泛的理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下1DTX影響HUVECS生物學(xué)行為的濃度依賴性細(xì)胞增殖結(jié)果表明，中等劑量的DTX（05NGML，5NGML）即可顯著抑制HUVECS的增殖且具有濃度和時(shí)間依賴性；流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明，高劑量的DTX（50NGML）出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞毒性，顯著促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡（包括早期凋亡，晚期凋亡和壞死）；細(xì)胞粘附結(jié)果表明，DTX僅延遲了細(xì)胞的粘附時(shí)間并未影響其粘附總數(shù)；單個(gè)HUVECS（活細(xì)胞工作站）和群體細(xì)胞（劃痕法和TRANSWELL法）的運(yùn)動(dòng)和遷移結(jié)果表明，低劑量的DTX（005NGML）可顯著抑制單個(gè)細(xì)胞和群體細(xì)胞的遷移。表明DTX抑制HUVECS遷移的效應(yīng)更加敏感。2DTX影響細(xì)胞增殖和的凋亡相關(guān)基因的表達(dá)采用免疫熒光和免疫印跡方法分別對(duì)反映細(xì)胞增殖情況的蛋白PCNA和表征細(xì)胞凋亡的蛋白P53的表達(dá)水平進(jìn)行了定性定量分析。研究結(jié)果表明DTX濃度愈高，PCNA的表達(dá)越低且P53的表達(dá)越高，說明DTX通過促進(jìn)促凋亡基因P53的表達(dá)加速了細(xì)胞的凋亡，這種效應(yīng)在DTX的濃度為50NGML時(shí)最為顯著。3DTX抑制HUVECS遷移的機(jī)制DTX顯著抑制了黏著斑蛋白INTEGRINΒ1的表達(dá)，降低了ROCK信號(hào)通路中MLC的磷酸化水平，且在ROCK的抑制劑Y27632預(yù)處理細(xì)胞后這種效應(yīng)愈加顯著，還大大降低了細(xì)胞的遷移數(shù)目。說明DTX可能是通過INTEGRINΒ1ROCK（P）MLC信號(hào)通路抑制細(xì)胞的遷移。4DTX影響了HUVECS的功能免疫熒光和免疫印跡定性定量研究表明，中等劑量的DTX（5NGML）顯著抑制了HUVECS細(xì)胞間粘附因子PECAM1的表達(dá)，表明其在一定程度上減弱了細(xì)胞間緊密程度，使得細(xì)胞間的粘附力降低。此外，DTX還顯著降低了HUVECS分泌NO的能力，表明DTX破壞了血管正常的收縮和舒張。

簡(jiǎn)介：第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文流體剪切力對(duì)大鼠成骨樣細(xì)胞生物學(xué)特性的影響姓名吳丹申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)口腔臨床醫(yī)學(xué)（口腔正畸學(xué)）指導(dǎo)教師丁寅20070501第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文2流體剪切力對(duì)大鼠成骨樣細(xì)胞生物學(xué)特性的影響流體剪切力對(duì)大鼠成骨樣細(xì)胞生物學(xué)特性的影響碩士研究生吳丹導(dǎo)師丁寅教授主任醫(yī)師第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科西安710032中文摘要中文摘要機(jī)械力是正畸牙移動(dòng)的前提和關(guān)鍵。在機(jī)械力作用下，通過牙齒將力傳遞至牙周組織，使其產(chǎn)生一系列組織學(xué)改變，從而引起牙槽骨的改建，進(jìn)而牙齒按照一定方向發(fā)生移動(dòng)。其中牙槽骨的交替吸收和增生是其改建的生物學(xué)基礎(chǔ)。而成骨細(xì)胞正是參與牙槽骨改建的主要細(xì)胞組成之一，它是骨發(fā)生和骨形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，在骨不斷的更新活動(dòng)中是最重要的功能細(xì)胞。成骨細(xì)胞的骨形成與破骨細(xì)胞的骨吸收兩者間保持動(dòng)態(tài)平衡是骨活動(dòng)保持正常狀態(tài)的基礎(chǔ)，而破骨細(xì)胞的活動(dòng)亦受到成骨細(xì)胞的調(diào)控。因此，研究在機(jī)械力誘導(dǎo)下成骨細(xì)胞增殖及活性變化及其影響因素就成為了解正畸牙牙槽骨改建機(jī)理的關(guān)鍵。成骨細(xì)胞是一種對(duì)應(yīng)力敏感的細(xì)胞，來源于多分化的間充質(zhì)干細(xì)胞，能分泌堿性磷酸酶（ALKALINEPHOSPHATASE，ALP）、骨鈣蛋白（OSTEOCALCIN，OCN），它們都是反映成骨細(xì)胞活性的特征性產(chǎn)物。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，機(jī)械力對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的影響是比較復(fù)雜的，細(xì)胞的反應(yīng)根據(jù)機(jī)械力作用方式不同而不同。有學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞對(duì)流體剪切力的反應(yīng)比對(duì)壓力及牽張力的反應(yīng)敏感得多。有實(shí)驗(yàn)表明活體中細(xì)胞對(duì)外力的反應(yīng)是由于外力通過組織間液流動(dòng)變化傳遞至細(xì)胞而產(chǎn)生

簡(jiǎn)介：碩士學(xué)位論文MIR23A和MIR30A對(duì)炎性環(huán)境下成骨細(xì)胞對(duì)炎性環(huán)境下成骨細(xì)胞生物學(xué)活性的影響研究生物學(xué)活性的影響研究楊博培養(yǎng)類別全日制學(xué)位類型專業(yè)學(xué)位一級(jí)學(xué)科專業(yè)類口腔醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科專業(yè)研究方向牙髓生物學(xué)指導(dǎo)教師陸群教授（主任醫(yī)師）培養(yǎng)單位口腔醫(yī)院牙體牙髓病科二O一三年五月第四軍醫(yī)大學(xué)THEFOURTHMILITARYMEDICALUNIVERSITY分類號(hào)R781UDC61631密級(jí)公開第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文目錄縮略語表1中文摘要3英文摘要6前言9文獻(xiàn)回顧11正文21實(shí)驗(yàn)一炎性牙齦、骨組織中MIR23A和MIR30A的表達(dá)改變研究211材料212方法213結(jié)果234討論24實(shí)驗(yàn)二牙周膜細(xì)胞及成骨細(xì)胞內(nèi)MIR23A和MIR30A的表達(dá)改變研究261材料262方法273結(jié)果294討論32實(shí)驗(yàn)三MIR23A和MIR30A對(duì)成骨細(xì)胞表面IL1、TNF受體表達(dá)的影響331材料332方法333結(jié)果364討論38實(shí)驗(yàn)四MIR23A和MIR30A對(duì)成骨細(xì)胞分化能力的影響研究401材料402方法40

簡(jiǎn)介：華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文LIVIN基因和SURVIVIN基因聯(lián)合靶向SIRNA對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的研究姓名蔡明申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)外科學(xué)（普外）指導(dǎo)教師王國(guó)斌20090501華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文6大腸癌細(xì)胞SURVIVINMRNA和蛋白的表達(dá)抑制率分別為3633％和4465％，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制，細(xì)胞凋亡率為1724213％。它可以協(xié)同5氟尿嘧啶增強(qiáng)對(duì)大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。結(jié)論結(jié)論SURVIVIN靶向SIRNA重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，它能有效抑制SURVIVIN基因表達(dá)、顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并能協(xié)同5氟尿嘧啶增強(qiáng)對(duì)大腸癌細(xì)胞的殺傷作用和誘導(dǎo)凋亡作用。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞SURVIVIN；RNA干擾；基因治療；化療第三部分LIVIN基因和SURVIVIN基因聯(lián)合靶向SIRNA對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的研究目的第三部分LIVIN基因和SURVIVIN基因聯(lián)合靶向SIRNA對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的研究目的采用1個(gè)載體編碼2個(gè)SHRNA技術(shù)，構(gòu)建LIVIN和SURVIVIN聯(lián)合靶向的SIRNA重組表達(dá)載體，觀察其協(xié)同誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞的凋亡效應(yīng)。方法方法構(gòu)建LIVIN和SURVIVIN聯(lián)合靶向的SIRNA重組表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞，通過RTPCR和WESTERNBLOT方法分別檢測(cè)LIVIN和SURVIVIN的表達(dá)，通過MTT法檢測(cè)SIRNA對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡效應(yīng)。結(jié)果結(jié)果經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序分析證實(shí)LIVIN和SURVIVIN聯(lián)合靶向的SIRNA重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，它對(duì)大腸癌細(xì)胞LIVIN和SURVIVIN的MRNA表達(dá)抑制率為2790％和3224％，對(duì)LIVIN和SURVIVIN蛋白表達(dá)的抑制率為2228％和4086％。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，細(xì)胞凋亡率為1169137％，但協(xié)同抑制作用比單獨(dú)干擾LIVIN或SURVIVIN基因弱。結(jié)論結(jié)論LIVIN和SURVIVIN聯(lián)合靶向的SIRNA重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，它能抑制LIVIN和SURVIVIN基因表達(dá)并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但協(xié)同抑制作用比單獨(dú)干擾LIVIN或SURVIVIN基因弱。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞LIVIN；SURVIVIN；RNA干擾；基因治療