金屬螯合色譜耦合人工伴侶輔助EGFP包含體蛋白質(zhì)復(fù)性.pdf

1、在基因工程表達(dá)中，為了表達(dá)后純化的需要，常常將融合標(biāo)簽（6×his）與目標(biāo)蛋白質(zhì)進行共表達(dá)，以利于金屬螯合色譜（IMAC）對其進行分離復(fù)性。然而，在純化和復(fù)性中，常會因樣品局部濃度過高引起蛋白質(zhì)聚集沉淀，而阻塞色譜柱及影響蛋白質(zhì)的純化和復(fù)性。為了減輕這些不利因素，開發(fā)有效和實用的包含體蛋白質(zhì)的復(fù)性技術(shù)，本文將金屬螯合色譜和人工伴侶系統(tǒng)相耦合，利用基因工程表達(dá)產(chǎn)物6×his標(biāo)記的增強型綠色熒光蛋白（EGFP）包含體，系統(tǒng)研究了耦合輔助復(fù)性

2、作用，并與傳統(tǒng)復(fù)性法進行了比較討論。 研究結(jié)果表明，稀釋復(fù)性僅能使較低濃度（0.05 mg·mL-1～0.2 mg·mL-1）的包含體蛋白達(dá)到較好的復(fù)性效果（30％～40％），但當(dāng)?shù)鞍捉K濃度為0.6 mg·mL-1時，熒光復(fù)性收率僅為14％；人工伴侶輔助復(fù)性雖然可使復(fù)性收率有所提高，但蛋白終濃度為0.6 mg·mL-1～0.8 mg·mL-1時，也只能達(dá)到25％左右的熒光復(fù)性收率；IMAC可以使高濃度包含體蛋白復(fù)性收率明顯提高，

3、在復(fù)性蛋白終濃度為0.6mg·mL-1時，熒光復(fù)性收率可達(dá)60％，質(zhì)量收率達(dá)80％；若將IMAC與人工伴侶耦合，相同條件蛋白質(zhì)的復(fù)性結(jié)果可進一步提高為熒光復(fù)性收率80％，質(zhì)量收率82％。 進一步對耦合輔助復(fù)性中關(guān)鍵操作參數(shù)進行優(yōu)化后，即變性蛋白與CTAB的摩爾濃度比為1：5，結(jié)合時間為20min，復(fù)性緩沖液的流速為0.4 mL·min-1，復(fù)性緩沖液中脲濃度為1.5 mol·L-1，洗脫液中脲濃度為2.5 mol·L-1時，可使

4、終濃度為0.8 mg·mL-1～～1.0 mg·mL-1的目標(biāo)蛋白質(zhì)達(dá)到87％的熒光復(fù)性收率和91％的質(zhì)量收率，并且即使在更高的進樣蛋白濃度（5 mg·mL-1）下，仍可獲得69％的熒光復(fù)性收率和66％的質(zhì)量收率，充分顯示了耦合輔助復(fù)性的優(yōu)勢和在實際應(yīng)用中的潛力。 此外，本文還通過體積排阻色譜和圓二色光譜對耦合輔助復(fù)性的產(chǎn)物進行了分析。結(jié)果表明，復(fù)性產(chǎn)物大多為單體EGFP，且產(chǎn)品的二級結(jié)構(gòu)和天然態(tài)綠色熒光蛋白相近。而其它復(fù)性方法