蛋白質(zhì)復(fù)性新方法的研究.pdf

1、D1蛋白酶(D1 C-terminal processing protease，CtpA)是植物葉綠體中的蛋白內(nèi)切酶，主要酶切D1蛋白前體(pD1)C端延伸的肽段，使pD1轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腄1蛋白(mD1)，用于光合系統(tǒng)Ⅱ中錳簇合物的組裝，具有維持光合系統(tǒng)Ⅱ損傷-修復(fù)循環(huán)過(guò)程的重要作用，該酶切過(guò)程是植物進(jìn)行光合作用必不可少的步驟。由于D1蛋白酶在光合系統(tǒng)中具有重要作用，因此被認(rèn)為是一種新型的除草劑作用靶標(biāo)，目前國(guó)內(nèi)外均在進(jìn)行基于該蛋白酶靶標(biāo)

2、的除草劑研究與開發(fā)。我們實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)采用基因工程方法，在大腸桿菌中成功地表達(dá)了菠菜CtpA蛋白，獲得了具有生物活性的可溶性蛋白酶，但大部分重組蛋白仍然以包涵體形式存在。為了獲得更多具有生物活性的蛋白酶，用于抑制劑先導(dǎo)化合物的篩選，需要對(duì)這些無(wú)活性的包涵體蛋白進(jìn)行變復(fù)性處理。
　　 由于重組D1蛋白酶在C端帶有組氨酸標(biāo)簽，本文采用親和色譜法對(duì)包涵體蛋白同時(shí)進(jìn)行了復(fù)性和純化，并采用SDS-PAGE電泳和熒光光譜法對(duì)復(fù)性后蛋白酶的純度及

3、復(fù)性效果進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選用TritonX-100(1％)溶液洗滌，不僅能夠除去部分雜質(zhì)蛋白，而且不會(huì)溶解目的蛋白造成損失。選用鹽酸胍作為變性劑溶解包涵體所得蛋白酶的純度要高于尿素作為變性劑時(shí)所得蛋白酶的純度。采用分步梯度法除去變性劑，包涵體蛋白實(shí)現(xiàn)了一定程度的復(fù)性，但我們認(rèn)為效果不甚理想，因此需要改進(jìn)除去變性劑的方法，或者在復(fù)性溶液中加入輔助劑輔助蛋白酶的復(fù)性。
　　 此外，本文還采用分子印跡法進(jìn)行了蛋白質(zhì)復(fù)性的研究