輔助因子促進蛋白質復性的研究.pdf

1、蛋白質的體外復性研究不僅對基因工程重組蛋白質的生產具有重要意義，而且對探索蛋白質錯誤折疊導致疾病的機理也具有積極的指導作用。本文以變性還原溶菌酶為模型蛋白質，研究了不同折疊輔助因子對促進蛋白質復性的作用；復性動力學特性；以及輔助因子與色譜耦合作用提高蛋白質復性收率的途徑。 首先研究了分子伴侶，固定化分子伴侶以及固定化分子伴侶色譜輔助蛋白質復性特性。結果表明，在1mol/L的最佳鹽酸胍濃度下，固定化分子伴侶色譜法的最高復性收率可

2、達到97％，復性產率達到54mg/L.h，是尺寸排阻色譜法的4倍，證明固定化分子伴侶色譜復性方法在高通量復性方面具有明顯的優(yōu)勢。 為了解明分子伴侶輔助蛋白質復性的動力學特性，建立了分子內折疊與分子間聚集的競爭反應動力學模型。模型分析表明，分子伴侶的存在可有效抑制聚集體的生成，降低聚集體反應級數(為2級反應)；三磷酸腺苷(ATP)作為多肽鏈釋放驅動劑是十分重要的，GroEL和ATP的同時作用可提高復性速率2倍以上；在一定的酶濃度

3、下，添加適當GroEL和ATP濃度，可實現蛋白質的高收率和高速度復性。 其次研究了人工伴侶系統(tǒng)，即十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)+β-環(huán)糊精(β-CD)促進高濃度變性溶菌酶的復性作用。結果表明，人工伴侶系統(tǒng)的輔助復性收率較直接稀釋的自發(fā)復性提高約70％，比僅有β-CD存在下的復性提高約40％。動力學分析表明，人工伴侶存在下聚集體的生成為三級反應，與直接稀釋復性相同；鹽酸胍和人工伴侶的作用都是抑制聚集體的生成，并且兩者具有協同

4、作用，利用此協同效應，可使高濃度的酶(1mg/mL)獲得高收率復性(＞80％)。此外，若有人工伴侶的存在，在較低濃度的鹽酸胍條件下就可實現快速、高收率的蛋白質復性。 根據上述人工伴侶輔助復性的研究成果，提出了尺寸排阻色譜與人工伴侶耦合作用促進蛋白質復性的耦合復性方法，并實驗證明該方法的有效性。利用此方法，獲得較高的復性收率的色譜流速高于單純的尺寸排阻色譜，因此利用耦合色譜有利于提高蛋白質復性產率。另外，該方法還可實現連續(xù)色譜復