甜味蛋白monellin分子的理性設計及改造.pdf

1、甜味蛋白monellin（莫內(nèi)林）由于自身具有高甜味（約為蔗糖的3000倍）和低卡路里的特點，因此在食品應用方面有較強的潛在價值。但是天然狀態(tài)下甜味蛋白monellin的耐熱穩(wěn)定性及耐酸堿穩(wěn)定性較弱，使得monellin在食品應用方面受到了極大的限制。
　　本研究中，我們首先根據(jù)甜味蛋白monellin的氨基酸序列(GenBank:AFF58925.1)，結(jié)合細菌密碼子的偏好性，人工設計合成單鏈monellin基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒并

2、將其導入到大腸桿菌內(nèi)進行表達，然后通過鎳親和層析以及分子篩層析分離純化獲得較純蛋白收集液。純化后的蛋白液進行透析實驗，然后通過相關(guān)實驗對其甜味閾值及熱穩(wěn)定進行研究。進一步利用凝血酶對表達蛋白進行酶切實驗，驗證組氨酸標簽并不會對甜味蛋白產(chǎn)生影響。
　　我們針對甜味蛋白monellin熱穩(wěn)定性較低這一特性，通過序列和結(jié)構(gòu)分析及基因突變的手段改變蛋白上不同位點的氨基酸，實現(xiàn)蛋白熱穩(wěn)性提高且甜度不會下降的目的。在這些突變中效果最為顯著的為

3、突變體E23A和C41A，前者是保持甜味閾值不升高且熱穩(wěn)定性相較于單鏈甜味蛋白monellin顯著提高，可在85℃溫度下保持30min不變性，后者則是熱穩(wěn)定性有較小的提升，且甜味閾值降低，比野生型甜味蛋白monellin甜度還要高。此外，我們還發(fā)現(xiàn)能夠提高蛋白熱穩(wěn)定性的突變體的氨基酸位點分布于α-螺旋的兩端。經(jīng)過本研究，我們證明可以通過基因突變手段來提高甜味蛋白monellin的穩(wěn)定性，實現(xiàn)甜味蛋白monellin的工業(yè)化生產(chǎn)，為人類提