基于鈣影像的甜味感應(yīng)細(xì)胞模型建立及應(yīng)用.pdf

1、人工甜味劑是一類(lèi)能賦予食品甜味的添加劑，并被廣泛運(yùn)用于食品等加工領(lǐng)域，近年來(lái)，對(duì)人工甜味劑安全性質(zhì)疑的研究不斷，然而對(duì)于人工甜味劑對(duì)機(jī)體的影響機(jī)制還尚不明確。而對(duì)其甜度的評(píng)價(jià)也一直依賴(lài)于人的感官品評(píng)，仍然沒(méi)有較直接的評(píng)價(jià)方法。由于品評(píng)人員個(gè)體、生活環(huán)境和閱歷等生理和心理的差異，對(duì)甜度客觀、真實(shí)感受的表達(dá)存在很大的制約性。人工甜味劑因其不提供或提供極低熱量在食品加工業(yè)中流行起來(lái)，因此，建立一種簡(jiǎn)單客觀的甜度評(píng)價(jià)方法極為重要。
　　甜

2、味感應(yīng)細(xì)胞是指能夠表達(dá)甜味受體蛋白且能夠識(shí)別甜味打開(kāi)下游信號(hào)通路的細(xì)胞。近十幾年來(lái)，有不少研究指出了人工甜味劑與甜味受體結(jié)合，引起胞內(nèi)甜味信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子Ca2+濃度的變化。本文正是從甜味劑甜度和味覺(jué)感受基礎(chǔ)的角度，以甜味感應(yīng)細(xì)胞作為研究對(duì)象，利用鈣影像的方法建立甜味感應(yīng)細(xì)胞模型NCI-H716細(xì)胞，對(duì)其暴露甜度12的人工甜味劑sucralose，通過(guò)qPCR，Western blot等實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察T1R2/T1R3在mRNA水平和蛋白水平

3、的表達(dá)情況，基于甜味受體表達(dá)量變化的基礎(chǔ)，通過(guò)鈣影像技術(shù)觀察人工甜味劑刺激的胞內(nèi)Ca2+釋放與T1R2/T1R3表達(dá)量相關(guān)性，人工甜味劑甜度，甜味受體表達(dá)量與甜味劑刺激的胞內(nèi)Ca2+濃度增量值是否成絕對(duì)的正相關(guān)性，從而初步探究基于甜味感應(yīng)細(xì)胞鈣影像的甜度檢測(cè)方法。同時(shí)深入探討了人工甜味劑影響機(jī)體健康的機(jī)制。
　　本課題旨在研究人工甜味劑甜度，甜味感應(yīng)細(xì)胞T1R2/T1R3表達(dá)量以及甜味劑刺激的胞內(nèi)Ca2+濃度增量值三者之間的相關(guān)性

4、。結(jié)果如下:
　　(1)甜味感應(yīng)細(xì)胞模型的建立
　　對(duì)HEK-293細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)甜味受體，通過(guò)qPCR的方式在基因水平對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行鑒定，成功構(gòu)建了瞬時(shí)表達(dá)甜味受體的HEK-293細(xì)胞（HEK-293T），另外用甜度600的sucralose同時(shí)刺激STC-1、NCI-H716和HEK-293T細(xì)胞，比較刺激引起的胞內(nèi)Ca2+濃度增量值，最終確定NCI-H716細(xì)胞為最佳的甜味感應(yīng)細(xì)胞模型。
　　(2)人工甜味劑長(zhǎng)期暴

5、露促進(jìn)甜味感應(yīng)細(xì)胞甜味受體蛋白表達(dá)量
　　在本實(shí)驗(yàn)室前期小鼠sucralose甜度偏好研究的基礎(chǔ)上，選擇甜度6和12的sucralose作為NCI-H716細(xì)胞的暴露甜度，甜度12的sucralose能夠更好的促進(jìn)甜味受體蛋白表達(dá)。隨后，用甜度12的sucralose暴露NCI-H716細(xì)胞，通過(guò)qPCR和western blot技術(shù)分別對(duì)暴露前后的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)均有較顯著的增強(qiáng)表達(dá)?？芍鸲?2的su

6、cralose長(zhǎng)期暴露NCI-H716細(xì)胞，可以誘導(dǎo)甜味受體蛋白表達(dá)量的增加。
　　(3)甜味受體蛋白表達(dá)量的增加促進(jìn)人工甜味劑刺激的胞內(nèi)Ca2+濃度增量增加
　　基于sucralose誘導(dǎo)的NCI-H716細(xì)胞甜味受體蛋白表達(dá)量增加，同等刺激條件下，胞內(nèi)Ca2+濃度增量隨著甜味受體蛋白表達(dá)量增加而增加。在不同甜度AK和sucralosre刺激NCI-H716細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)Ca2+濃度增量與人工甜味劑甜度呈正相關(guān)性，而等甜度

7、的AK和sucralose同樣條件下刺激的胞內(nèi)Ca2+濃度增量不一致。
　　(4) sucralose（一定甜度范圍內(nèi)）可用甜味劑刺激的胞內(nèi)Ca2+濃度增量值來(lái)評(píng)估甜度。
　　通過(guò)計(jì)算單位受體單位甜度AK和sucralose刺激的胞內(nèi)Ca2+濃度增量值，發(fā)現(xiàn)，sucralose在甜度200-600之間，單位受體單位甜度刺激引起的胞內(nèi)Ca2+增量值(AUC)是一致的，將這個(gè)值作為一個(gè)常數(shù)(K)，可得到甜度等于單位受體單位甜度刺