細(xì)胞色素P450BM-3半理性分子改造研究.pdf

1、細(xì)胞色素P450 BM-3(CYP102A)是一種單加氧酶，具有脂肪酸羥基化活性。野生型P450 BM-3酶能催化長鏈飽和或不飽和脂肪酸。經(jīng)過蛋白質(zhì)改造，P450BM-3酶催化底物的范圍擴(kuò)展至烷烴、環(huán)烷烴等，其中P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)可以催化吲哚進(jìn)行羥基化反應(yīng)。本研究為了改善P450 BM-3酶的催化活性和熱穩(wěn)定性，并擴(kuò)展酶的底物譜，采用半理性設(shè)計(jì)方法，對P450 BM-3進(jìn)行了蛋白質(zhì)工程改造，得到了多個(gè)催

2、化性能得到改善的突變酶，并對突變酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系進(jìn)行了分析。
　　首先，以P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q/D422G)為親本，利用B-FITFER分析方法對P450 BM-3的458個(gè)氨基酸進(jìn)行b-factor值測定，篩選對熱穩(wěn)定性最可能產(chǎn)生影響的位點(diǎn)，并結(jié)合蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)將位點(diǎn)控制在底物通道入口最終確定突變位點(diǎn)，而后對該位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，從而進(jìn)一步篩選出催化活力或熱穩(wěn)定性得到提高的突變酶P450 BM

3、-3(A74G/F87V/L188Q/D422G/G46S)（以下簡稱為突變酶G46S）。對突變酶的基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該突變酶的半失活溫度(T5010)比親本酶提高了5℃（達(dá)到48℃）;在50℃的半衰期t1/2比親本酶延長了一倍;突變酶Km降低了22％，kca,提高了90％，催化效率kcat/Km(67.42min-1·mM-1)比親本提高了1.48倍。
　　第二，以P450-BM-3(A74G/F87V/L188Q)為親

4、本，對46位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)飽和突變，以進(jìn)一步考察該位點(diǎn)對于對P450 BM-3催化功能的影響性質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從46位殘基的定點(diǎn)飽和突變文庫中篩選得到了6個(gè)催化吲哚形成靛藍(lán)活力得到提高的突變酶P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q/G46N)(以下簡稱為G46N突變酶，N指代不同的氨基酸): G46Y、G46E、G46W、G46R、G46V和G46S突變酶(其中G46S突變酶區(qū)別于第一部分的突變酶G46S)。其中，催化效率提高最

5、多的是G46W突變酶，其催化效率接近于親本酶的7.03倍。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，G46E、G46Y和G46W突變酶不僅催化吲哚羥基化能力提高，其熱穩(wěn)定性也得到了提高。
　　第三，為了拓展P450 BM-3的催化專一性、得到可以催化甾醇類底物羥基化反應(yīng)的突變酶，對P450 BM-3進(jìn)行了進(jìn)一步的半理性改造。利用hotspot軟件分析可能影響酶專一性改變的位點(diǎn)，然后通過Swiss-model在線模擬蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)構(gòu)建序列突變酶，篩選出對于底物通

6、道入口結(jié)構(gòu)有所改變的突變方式，最終得到以P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)為親本，蛋白質(zhì)的N端截?cái)?0個(gè)氨基酸的突變酶（以下簡稱為-20突變酶），然后通過定點(diǎn)突變構(gòu)建了真實(shí)的-20突變酶，進(jìn)并對其催化甾醇類物質(zhì)羥基化反應(yīng)的性質(zhì)進(jìn)行了考察。雖然最終沒有獲得可以催化甾醇類物質(zhì)羥基化的P450 BM-3突變酶，但為采用分子設(shè)計(jì)手段構(gòu)建可催化甾醇底物的P450 BM-3工程酶進(jìn)行了有益的嘗試。
　　本研究應(yīng)用半理性分子設(shè)