種植體表面RNAi功能化修飾以及形貌分子機(jī)制的系列研究.pdf

1、背景：鈦種植體是目前應(yīng)用于口腔牙齒缺失較為理想的修復(fù)材料。雖然大量的臨床病例證實(shí)該技術(shù)成功率較高，然而仍存在由于骨結(jié)合不良造成的失敗案例。因此，如何提高種植體骨結(jié)合能力仍是研究的熱點(diǎn)。利用生物分子進(jìn)行種植體的表面活化具有生物活性強(qiáng)、生物相容性好等優(yōu)勢(shì)，是目前較為常用的手段。其中，利用 RNAi技術(shù)對(duì)種植體表面活化具有作用靶向、穩(wěn)定、持久等優(yōu)點(diǎn)，是生物活化中的研究熱點(diǎn)。種植體的表面物理形貌優(yōu)化也具有很強(qiáng)的應(yīng)用前景，而對(duì)于形貌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

2、尚不明確。我們課題組在前期進(jìn)行了大量的關(guān)于微米坑結(jié)構(gòu)和納米管結(jié)構(gòu)影響成骨分化相關(guān)的分子信號(hào)通路進(jìn)行了初步闡釋，然而尚有諸多問題未得到深入研究。因此，深入探索種植體表面形貌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制也是研究的重點(diǎn)方向。
　　為此，本研究共分為兩個(gè)部分，第一部分是采用相關(guān)物理化學(xué)手段對(duì)鈦種植體表面進(jìn)行RNAi功能化修飾，主要包括簡(jiǎn)單吸附、分子自組裝和陰極電沉積等方法；第二部分是研究鈦種植體表面形貌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，主要從亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)角度

3、進(jìn)行闡釋。本研究旨在尋找更為優(yōu)良的種植體表面修飾技術(shù)，進(jìn)而提高種植體骨結(jié)合；另一方面，為了更好的闡釋生物材料表面微觀結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞行為影響的本質(zhì)，從而為指導(dǎo)生物材料的表面結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)提供理論支持。
　　目的：探索鈦種植體表面 RNAi功能化修飾的可行性和修飾方法；探索siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞自噬的關(guān)系；闡明鈦種植體表面形貌對(duì)細(xì)胞器的影響；闡明鈦種植體表面形貌對(duì)細(xì)胞自噬的影響。
　　方法：
　　第一部分、鈦種植體表面RNAi功能化修

4、飾
　　1.采用微弧氧化、陽極氧化等方法在鈦種植體表面構(gòu)建微米級(jí)孔洞和納米管形貌；使用的轉(zhuǎn)運(yùn)載體主要為殼聚糖；miRNA包括miR-148b和陰性對(duì)照；siRNA包括siGFP和siCkip-1等；采用直接混合的方式形成不同的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。
　　2.利用簡(jiǎn)單吸附過程，將殼聚糖/miRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物涂布在微弧氧化鈦表面，真空冷凍干燥；分子自組裝過程利用帶正電的殼聚糖/siRNA復(fù)合物和帶負(fù)電的透明質(zhì)酸交替孵育沉積在光滑鈦表面；陰

5、極電沉積方法將納米管化的鈦種植體連接到負(fù)極，使用殼聚糖的鹽酸溶液與siRNA形成復(fù)合物作為電解液，石墨做正極，低電壓下進(jìn)行加載。
　　3.使用掃描電鏡、熒光顯微鏡、激光共聚焦、原子力顯微鏡等手段進(jìn)行材料表面表征；利用熒光強(qiáng)度定量檢測(cè)涂層加載效率和釋放規(guī)律；細(xì)胞轉(zhuǎn)染后激光共聚焦觀察轉(zhuǎn)染效率；流式細(xì)胞儀和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因沉默效率；在材料表面進(jìn)行成骨分化實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)ALP活性、膠原分泌以及礦化狀況，評(píng)估種植體表面促進(jìn)成骨分化的能力。

6、
　　4.分別使用脂質(zhì)體2000和殼聚糖與siRNA形成lipoplex和polyplex復(fù)合物轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞，MDC染色和western blot檢測(cè)自噬水平變化；在自噬調(diào)節(jié)藥物存在情況下轉(zhuǎn)染細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞攝取效率和基因沉默效率；免疫熒光染色觀察細(xì)胞內(nèi)siRNA和自噬小體的分布。
　　第二部分、鈦種植體表面形貌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
　　1.采用酸蝕+陽極氧化、堿熱處理、過氧化氫腐蝕等方法在鈦種植體表面構(gòu)建不同的形

7、貌。
　　2.將成骨細(xì)胞系MG63培養(yǎng)在不同形貌材料表面，采用細(xì)胞器特異性熒光探針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，激光共聚焦觀察細(xì)胞器的分布狀況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度；實(shí)時(shí)定量PCR和western blot檢測(cè)細(xì)胞器特異性標(biāo)識(shí)表達(dá)；透射電鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PERK通路關(guān)鍵分子表達(dá)。
　　3.將成骨細(xì)胞系MC3T3-E1培養(yǎng)在不同形貌材料表面，采用MDC方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，檢測(cè)自噬活性；透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬泡的形成和結(jié)

8、構(gòu)特征；western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)變化；羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽進(jìn)行細(xì)胞骨架染色；掃描電鏡觀察細(xì)胞偽足；鈣離子探針染色胞漿鈣離子濃度；在種植體表面進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化，干預(yù)自噬活性，檢測(cè)ALP活性和礦化形成。
　　結(jié)果：
　　第一部分、鈦種植體表面RNAi功能化修飾
　　1.微弧氧化和陽極氧化分別能夠在純鈦種植體表面形成微米級(jí)孔洞結(jié)構(gòu)和納米管陣列。
　　2.利用簡(jiǎn)單吸附過程能夠?qū)崿F(xiàn)殼聚糖/miRNA復(fù)合物

9、在微弧氧化表面的均勻加載，復(fù)合物能夠深入微米孔洞內(nèi)部；掃描電鏡下涂層分布均勻；早期涂層中miRNA釋放迅速，隨后釋放緩慢；可以實(shí)現(xiàn)大鼠原代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染；使用miR-148b后能夠顯著促進(jìn)其成骨分化；細(xì)胞活性維持在80％以上。
　　3.分子自組裝技術(shù)能夠在鈦表面形成多層結(jié)構(gòu)包裹殼聚糖/siRNA復(fù)合物；原子力顯微鏡顯示表面粗糙度發(fā)生交替波動(dòng)；掃描電鏡顯示殼聚糖與透明質(zhì)酸形成嵌合結(jié)構(gòu)；siRNA的加載量隨著層數(shù)的增加而

10、增加；釋放速率緩慢；使用siGFP加載后可持續(xù)的沉默H1299細(xì)胞中GFP的表達(dá)，細(xì)胞相容性良好；使用siCkip-1后能夠顯著促進(jìn)MG63的成骨分化。
　　4.利用陰極電沉積可迅速的將殼聚糖/siRNA復(fù)合物加載到納米管表面；熒光顯微鏡和掃描電鏡顯示隨著電流密度的增加，涂層分布逐漸覆蓋納米管口；在短時(shí)間內(nèi)siRNA加載量與加載電壓和加載時(shí)間成正比；在不同pH中siRNA釋放模式不同，在酸性環(huán)境中較快，中性和堿性環(huán)境中較慢；加載s

11、iGFP后能夠?qū)崿F(xiàn)靶基因持續(xù)性沉默和細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染；對(duì)細(xì)胞粘附和活力無顯著影響；使用siCkip-1后能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞成骨分化。
　　5.使用lipoplex和polyplex轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞后能夠誘發(fā)mTOR-independent自噬反應(yīng)；不同自噬調(diào)節(jié)藥物對(duì)細(xì)胞攝取效率無顯著影響；rapamycin和TG顯著促進(jìn)siRNA沉默效率，LiBr和3-MA顯著減弱siRNA沉默效率；不同自噬調(diào)節(jié)藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離siRNA的比例產(chǎn)生不

12、同影響，與沉默效率相對(duì)應(yīng)。
　　第二部分、鈦種植體表面形貌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
　　1.采用酸蝕+陽極氧化、堿熱處理、過氧化氫腐蝕等方法分別能在鈦種植體表面構(gòu)建出微米坑-納米管、納米線、納米孔洞形貌。
　　2.微納米形貌表面MG63細(xì)胞器分布和數(shù)量未受到顯著影響；與光滑鈦相比，細(xì)胞器特異性標(biāo)識(shí)表達(dá)均在第1天時(shí)下降，第3天后恢復(fù)正常水平；透射電鏡顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)張；PERK通路關(guān)鍵分子表達(dá)上調(diào)。
　　3.納米管形貌誘發(fā)MC3T

13、3-E1暫時(shí)性、可逆性的自噬反應(yīng)；形貌誘發(fā)的自噬反應(yīng)類型屬于mTOR-independent類型；細(xì)胞骨架分布在納米管表面鋪展明顯，細(xì)胞邊緣絲狀偽足豐富，胞漿內(nèi)鈣離子濃度上升；納米線、納米孔洞均可誘發(fā)類似的自噬反應(yīng)；納米管結(jié)構(gòu)同時(shí)也能夠在Hela和H1299兩種腫瘤細(xì)胞系中誘發(fā)自噬反應(yīng)；應(yīng)用自噬潮抑制劑后種植體表面成骨細(xì)胞ALP活性顯著下調(diào)；細(xì)胞在與納米管形貌早期接觸后分離，納米管促進(jìn)成骨分化的能力仍能夠保持。
　　結(jié)論：