利用羅非魚魚皮及刺參體壁制備ACE抑制肽.pdf

1、膠原肽是指膠原蛋白經(jīng)蛋白酶降解制備獲得，具有一定生理功能的活性多肽。膠原肽由于其較小的分子量易被消化吸收，同時具有降血壓、抗氧化、抗腫瘤等生物活性，因此在生物醫(yī)藥、保健品及美容領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　本文首先以羅非魚(Oreochromis sp)魚皮為原料，通過酸法制備得到高純度的膠原蛋白(ASC)。利用南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)蝦頭肝胰腺中制備的胰蛋白酶，對羅非魚魚皮膠原蛋白進行酶解，通過單因

2、素法對其制備工藝進行優(yōu)化。優(yōu)化獲得酶解的最佳工藝參數(shù)為:加酶量17，000U/g，酶解時間90min，酶解溫度40℃，pH8.0。其中酶解產(chǎn)物分子量＜3kDa多肽所占比例為99.7％。利用SP-Sepharose陽離子交換柱層析，Sephadex G-15凝膠過濾柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)，從該酶解產(chǎn)物中純化獲得高純度的ACE抑制肽。經(jīng)MALDI-TOF/TOF-MS/MS分析確定其氨基酸序列為NPARTCR，經(jīng)測定其A

3、CE抑制活性IC50值為61.4μmol/L。用脯氨酸內(nèi)肽酶(PSEP)對該七肽進行酶解，制備獲得更高ACE抑制活性的五肽ARTCR，其ACE抑制活性IC50值為77.0μmol/L。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法對兩種ACE抑制肽的抑制模式進行研究，NPARTCR和ARTCR對ACE酶均表現(xiàn)為非競爭性抑制作用。穩(wěn)定性結(jié)果表明，在高溫、酸性和堿性條件下NPARTCR和ARTCR均具有較好的穩(wěn)定性，其中NPARTCR在模擬

4、腸液消化中，被降解成了分子量更小的多肽，消化產(chǎn)物失去ACE抑制活性，但ARTCR具有較強的抵抗胃腸道蛋白酶消化的能力。同時NPARTCR和ARTCR均不會對Caco-2細胞產(chǎn)生毒性作用。NPARTCR實驗組SHR大鼠在灌胃后血壓無顯著性降低，而ARTCR對SHR大鼠表現(xiàn)出良好的降壓效果，降血壓效果可以維持12h。
　　刺參(Stichopus japonicus)是名貴的海洋生物，其可食部體壁中膠原纖維含量占其蛋白總量的70％，是

5、制備生物活性肽的良好蛋白原料。本文以刺參體壁為原料，采用復(fù)合蛋白酶為工具酶，以Tricine-SDS-PAGE電泳分析和ACE抑制率為考核指標，運用單因素法優(yōu)化刺參ACE抑制肽的酶解工藝。獲得最佳工藝參數(shù)為:料液比1∶6，加酶量0.8％(w/w)，反應(yīng)時間6h，pH7.0。結(jié)合膜分離技術(shù)制備不同分子量的多肽，其中酶解產(chǎn)物＜3kDa組分具有較高的ACE抑制活性IC50為0.8mg/mL，對ACE表現(xiàn)為非競爭性抑制作用，同時ABTS、DPP

6、H·和·OH自由基清除能力的EC50值分別為2.25mg/mL、3.47mg/mL、7.03mg/mL。刺參肽在高溫、酸性和堿性條件下均具有較好的穩(wěn)定性，并具有較強的抵抗胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化的能力。此外，刺參肽不會對Caco-2細胞產(chǎn)生毒性作用。SHR大鼠灌胃刺參ACE抑制肽，在濃度為300mg/kg時對SHR大鼠表現(xiàn)出良好的降壓功效，灌胃后2h，SHR大鼠的血壓顯著降低，在給藥后4h SBP降幅達到最高，為26mmHg