固定化酶制備牡蠣ACE抑制肽及抗氧化肽.pdf

1、為了通過食療的方法預防并治療高血壓及自由基氧化損傷等疾病,滿足人類對健康飲食及醫(yī)療安全的要求,提高海洋資源利用率,研究酶法制備海洋生物活性肽成為解決問題的有效手段之一。牡蠣由于兼具豐富的營養(yǎng)保健及藥效價值,是開發(fā)海洋生物活性肽的重要來源,同時固定化酶與切向流超濾膜系統(tǒng)的結合在操作結構及分離效果方面的優(yōu)勢在工業(yè)化生產海洋生物活性肽中具有廣闊的應用空間及發(fā)展?jié)摿Α?br>　　本課題主要探索了固定化酶及切向流超濾膜系統(tǒng)制備牡蠣ACE抑制肽及抗

2、氧化肽的工藝條件,并經凝膠過濾層析及高效液相色譜對活性肽進一步分離純化,分析其分子量分布及多肽結構特性,為研究海洋活性肽的制備工藝及構效關系提供理論支持,同時為固定化酶及超濾膜系統(tǒng)的工業(yè)化應用及海洋生物活性肽產品的產業(yè)化提供參考依據。主要研究結果如下:
　　(1)以肽得率及水解度為指標,胰蛋白酶制備ACE抑制肽的優(yōu)化條件為蛋白濃度50mg/mL,溫度40℃,pH8.0,加酶量5000U/g,酶解時間8h,ACE抑制率達到36％-3

3、7%。制備抗氧化肽的最佳條件為溫度45℃,pH為7.5,加酶量6000U,酶解時間為7.5h,DPPH自由基清除率最高達83.22%,羥基自由基清除率最高達95.69%。溫度對游離酶制備牡蠣ACE抑制肽及抗氧化肽均具有顯著性影響。
　　(2)探索了固定化載體材料及固定化酶制備工藝,選擇制備海藻酸鈉及殼聚糖混合凝膠作為固定化酶的載體,正交試驗優(yōu)化得到共混凝膠包埋吸附法制備固定化胰蛋白酶的最佳工藝條件為0.4%戊二醛,4.5%CaCl

4、2,加酶量1:15,吸附交聯(lián)14h,酶比活力最高達128.39U/g,此法制備的固定化酶穩(wěn)定性、機械強度及使用效率均有所提高。
　　(3)優(yōu)化了固定化酶酶解牡蠣蛋白制備ACE抑制肽及抗氧化肽的工藝條件。在蛋白濃度為50mg/mL條件下,得到ACE抑制率達38.82%的牡蠣ACE抑制肽,最佳制備工藝是pH為9.0,溫度為50℃,加酶量為5g/g底物,反應時間為3.5h,固定化酶可重復使用五次。制備抗氧化肽的最佳工藝條件是pH9.0,

5、溫度為45℃,加酶量為3g/g底物,反應時間為1.5h,DPPH自由基清除率達到93.68%,固定化酶可重復使用七次以上,與游離酶酶解效果相比,可以獲得活性更高的ACE抑制肽及抗氧化肽。
　　(4)切向流超濾膜系統(tǒng)有效分離純化一定分子量的牡蠣ACE抑制肽及抗氧化肽組分,經凝膠層析色譜及高效液相色譜對其分子量分布及疏水性進行分析鑒定。研究不同截流分子量超濾片段與抗氧化活性、ACE抑制率及多肽產率的關系,ACE抑制肽及抗氧化肽活性均是

6、不同分子量肽段共同作用的結果,抗氧化肽活性主要集中在大于10kDa及小于3kDa的肽段,其中,大于10kDa肽段多肽產率及羥基清除率最高,小于3kDa肽段多肽產率其次,而DPPH自由基清除率最高。ACE抑制肽活性主要集中在小于1kDa分子量范圍且多肽產率最高。
　　通過最佳工藝擴大驗證,固定化酶及切向流超濾膜系統(tǒng)可以制備一定分子量活性較高且性質穩(wěn)定的牡蠣ACE抑制肽及抗氧化肽,為特色海產品的高級精深加工及海洋活性肽產品的工業(yè)化生產