一種在凝膠中快速檢測蛋白質(zhì)的新方法及其機制研究.pdf

1、實驗?zāi)康模?br>　　本研究利用2’，7’-二氯熒光素染料建立一種快速、靈敏的負(fù)染蛋白質(zhì)檢測新技術(shù)，并針對2’，7’-二氯熒光素與蛋白質(zhì)相結(jié)合的具體的檢測機制展開討論。
　　實驗方法：
　　通過查閱文獻，了解到熒光素類染料具有結(jié)合蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的特性。我們選擇2’，7’-二氯熒光素作為染料檢測凝膠中的蛋白質(zhì)分子，在染色過程中針對染色液的組成、染色時間以及顯影液的組成成分等影響因素進行方法學(xué)的優(yōu)化，最終確立一種高靈敏

2、、快速的凝膠中檢測蛋白質(zhì)的新方法。其次，通過混合的六種蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品以及從鼠腦和大腸桿菌菌株中提取的總蛋白質(zhì)實際樣品考察這種方法的穩(wěn)定性。運用計算機軟件模擬牛血清白蛋白與2’，7’-二氯熒光素染料分子結(jié)合的情況，從而推斷出牛血清白蛋白與2’，7’-二氯熒光素發(fā)生結(jié)合的具體機制。同時，為了驗證該方法的質(zhì)譜兼容性，我們選取了總量為50 ng左右的4種不同的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)進質(zhì)譜，用2’，7’-二氯熒光素負(fù)染方法與鋅咪唑負(fù)染染色方法進行對比。

3、>　　實驗結(jié)果：
　　通過方法學(xué)的優(yōu)化，我們確立了2’，7’-二氯熒光素的負(fù)染方法：在染料濃度為0.3％，碳酸鈉的濃度為0.1%和甲醇溶液比例為50%（其余組成為水）的染色液中染色5分鐘，顯影液由檸檬酸與檸檬酸三鈉的緩沖液（pH值為4.0）組成，顯影1到2分鐘。最后，利用黑色背景觀察染色結(jié)果。2’，7’-二氯熒光素負(fù)染方法具有較好的可重復(fù)性、線性范圍以及較好的質(zhì)譜兼容性。在標(biāo)準(zhǔn)蛋白以及從鼠腦和大腸桿菌中提取的總蛋白質(zhì)樣品進行不同方

4、法染色，通過對比發(fā)現(xiàn)，2’，7’-二氯熒光素的負(fù)染方法的靈敏度可達0.1~0.2 ng，是銀染法靈敏度的4倍，是鋅咪唑負(fù)染方法靈敏度的8倍。通過運用Autodock軟件對牛血清白蛋白與2’，7’-二氯熒光素染料分子的結(jié)合情況進行模擬，可以發(fā)現(xiàn)2’，7’-二氯熒光素與牛血清白蛋白主要是通過氫鍵、范德華力以及靜電力三種不同的作用力結(jié)合。
　　結(jié)論：
　　本文旨在建立一種新型的基于2’，7’-二氯熒光素的快速、靈敏、低毒的凝膠中檢