單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)新方法研究.pdf

1、后基因組時(shí)代，以核酸、蛋白質(zhì)、代謝物以及它們之間相互作用網(wǎng)絡(luò)為對(duì)象的各種“組學(xué)”研究，已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)生命的化學(xué)基礎(chǔ)和加速人們對(duì)其分子機(jī)制更加深入了解的主要工具。尤其是最年來(lái)，癌癥和干細(xì)胞等領(lǐng)域的重大突破揭示了群體細(xì)胞中某些細(xì)胞在功能上表現(xiàn)出的異質(zhì)性，對(duì)“組學(xué)”研究向單細(xì)胞水平延伸提出了明確的需求，催生了多種單細(xì)胞分析方法產(chǎn)生和快速發(fā)展，例如，微流控芯片、流式細(xì)胞術(shù)、質(zhì)譜、拉曼光譜等高靈敏度、高通量和高分辨率的分析手段，為單細(xì)胞基因組、單細(xì)

2、胞蛋白質(zhì)組和單細(xì)胞代謝組等單細(xì)胞組學(xué)研究提供了強(qiáng)大的研究手段。
　　流式細(xì)胞術(shù)和化學(xué)細(xì)胞術(shù)是單細(xì)胞蛋白質(zhì)組研究的兩大核心技術(shù)?；谧罱l(fā)展起來(lái)的基于活性的熒光探針（ABP, Activity-Based Probe）技術(shù)，本文提出一種新的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)（Single-cell proteomics）分析方法，將流式細(xì)胞術(shù)功能性標(biāo)記理念與化學(xué)細(xì)胞術(shù)的單細(xì)胞全局蛋白質(zhì)組分析理念相結(jié)合，從功能入手，建立了單細(xì)胞功能蛋白質(zhì)組研究新策略。

3、基于該策略，構(gòu)建了達(dá)到單細(xì)胞檢測(cè)水平的毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光系統(tǒng)，并結(jié)合ABP探針的特異性和熒光報(bào)告特性，對(duì)細(xì)胞表面低豐度的膜受體蛋白家族（GABAB受體）和細(xì)胞器內(nèi)的難以標(biāo)記的蛋白酶（半胱氨酸組織蛋白酶）進(jìn)行單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析。主要工作內(nèi)容如下：
　?。?）發(fā)展了高分辨率、高靈敏度、適用于單細(xì)胞分析的毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光裝置。構(gòu)建了單細(xì)胞進(jìn)樣裝置，能夠精準(zhǔn)地將單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞導(dǎo)入毛細(xì)管中，并驗(yàn)證了系統(tǒng)的可靠性；利用聚丙烯酰胺等

4、對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行了共價(jià)修飾，以防止蛋白質(zhì)吸附并提高分離效率，對(duì)分子量標(biāo)記蛋白質(zhì)進(jìn)行分離表明，其分辨率達(dá)到了文獻(xiàn)報(bào)道的最好水平；采用熒光素樣品，證實(shí)了本系統(tǒng)的檢測(cè)限為4×10-12M；對(duì)毛細(xì)管區(qū)帶電泳和毛細(xì)管篩分電泳兩種電泳模式，都獲得了較高的重現(xiàn)性。
　　（2）基于上述平臺(tái)，發(fā)展了一種基于ABP的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)新方法，并詳細(xì)研究了細(xì)胞膜表面低豐度GABAB家族功能性蛋白質(zhì)組表達(dá)。ABP探針在分子結(jié)構(gòu)上由串聯(lián)的3個(gè)功能域(ABC)

5、構(gòu)成：A域?yàn)橄驅(qū)^(qū)，通過(guò)識(shí)別靶蛋白質(zhì)與其形成非共價(jià)結(jié)合；B域?yàn)殄^定區(qū)，通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)將該分子共價(jià)結(jié)合在靶蛋白質(zhì)上；C域?yàn)橹甘緟^(qū)，為高靈敏的熒光分子結(jié)構(gòu)。通過(guò)ABP探針，可以高選擇性地實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞上指定的蛋白質(zhì)群的功能化標(biāo)記；標(biāo)記的細(xì)胞再通過(guò)單細(xì)胞毛細(xì)管電泳獲得單細(xì)胞功能性蛋白質(zhì)組表達(dá)譜。為驗(yàn)證該方法的可靠性，首先獲得了單個(gè)HEK細(xì)胞的GABAB1(GB1)-like蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，通過(guò)對(duì)比過(guò)量表達(dá)GB1的HEK細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜和蛋白質(zhì)分子量

6、譜，確認(rèn)了GB1在圖譜中的位置；在單細(xì)胞水平，對(duì)比了GB1在HEK、MEF和CHO等不同細(xì)胞系之間以及同一MEF細(xì)胞系內(nèi)不同細(xì)胞之間的表達(dá)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞系之間或同一細(xì)胞系不同細(xì)胞之間差異明顯；將上述方法應(yīng)用于小鼠原代顆粒神經(jīng)元細(xì)胞(CGN)的GB1表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)同源細(xì)胞群體內(nèi)部的細(xì)胞異質(zhì)性，進(jìn)一步的GB1拮抗劑和激活劑的藥物競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)證實(shí)了結(jié)果的可靠性。
　?。?）對(duì)于細(xì)胞胞質(zhì)、甚至細(xì)胞器內(nèi)的各種酶類而言，細(xì)胞膜成為了阻礙活性

7、探針進(jìn)入細(xì)胞并標(biāo)記它們的第一道屏障。針對(duì)半胱氨酸組織蛋白酶的，設(shè)計(jì)能夠透過(guò)細(xì)胞膜的ABP探針，用活細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光成像的方法確定了探針?lè)跤?、恢?fù)時(shí)間等細(xì)胞標(biāo)記的關(guān)鍵參數(shù)。基于該ABP探針和單細(xì)胞功能蛋白質(zhì)組分析新策略，研究了單個(gè)細(xì)胞水平半胱氨酸組織蛋白酶的表達(dá)譜。并對(duì)比了群體細(xì)胞水平半胱氨酸組織蛋白酶PAGE檢測(cè)及質(zhì)譜鑒定結(jié)果，證實(shí)了結(jié)果的可靠性。
　　綜上所述，本文發(fā)展的單細(xì)胞功能性蛋白質(zhì)組學(xué)新方法既能夠研究細(xì)胞膜表面的低豐度表面膜