一種基于“納米酶”體系的DNA檢測新方法.pdf

1、本文構建了一種用于DNA雜交檢測的“納米酶”體系。首先通過檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法制備粒徑約15nm的納米金顆粒（Au Nanoparticles，AuNPs)，利用蛋白分子與納米金顆粒之間的相互作用，在納米金顆粒表面連接辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)分子，然后利用金硫鍵的作用在納米金表面組裝末端帶有巰基修飾的單鏈DNA檢測探針，構成了一種以納米金為中心的“rDNA-納米金-HRP”結構的納米

2、單元，集成了靶物質(zhì)檢測與信號放大功能，被命名為“納米酶”。 在應用該“納米酶”體系進行夾心法檢測DNA的實驗中，首先在親和素包被的磁性微粒(magneticmicroparticles，MMPs)表面組裝上生物素修飾的DNA捕獲探針，通過與靶DNA序列的雜交作用捕獲游離在檢測樣品溶液中的靶DNA，經(jīng)過磁性分離對產(chǎn)物進行富集之后，再與納米酶進行雜交反應。洗脫非特異的吸附之后，加入顯色底物ABTS(2，2’-Azino—bis(3

3、-Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonic Acid))或熒光底物HPPA(3-(4-Hydroxyphenyl)propionic acid)進行酶催反應。 結果表明，反應后產(chǎn)物溶液的光吸收值或者熒光強度與靶DNA的濃度在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關系。由于一個納米金顆粒上可以結合多個DNA和HRP分子，起到了信號放大的作用，且磁性微粒起到了濃縮樣品、富集靶物質(zhì)的作用，這種檢測方法顯示出良好的靈敏度和可重現(xiàn)性

4、。采用顯色底物反應，根據(jù)酶催反應產(chǎn)物在405nm處的吸光值繪制工作曲線，該方法對靶DNA的最低檢測限在30pM左右，有效檢測范圍大約在100pM至3nM之間；采用熒光底物反應，反應產(chǎn)物在激發(fā)波長320nm,發(fā)射波長405nm條件下測得熒光強度，結果能夠?qū)z測極限降低到3pM左右，且具有更大的檢測范圍，大約在10pM至IOnM之間。在對照實驗中，這種應用“納米酶”的雜交檢測體系表現(xiàn)出良好的特異性，用不能與探針互補的DNA作為陰性對照，與含