雙功能肽tLyP-1-NLS修飾的DNA納米膠束的構(gòu)建及其抗腫瘤作用研究.pdf

1、腫瘤是生長于靶器官卻與其不相協(xié)調(diào)的組織團(tuán)塊的異常增生，惡性腫瘤由于其細(xì)胞可侵犯、浸潤?quán)徑M織細(xì)胞，并能通過血液或淋巴系統(tǒng)從原發(fā)部位轉(zhuǎn)移到其他組織形成新的瘤塊的特點(diǎn)，導(dǎo)致其難以治愈。傳統(tǒng)的治療手段均存在對機(jī)體損傷大、風(fēng)險高、易于復(fù)發(fā)的問題，而基因治療由于其獨(dú)特的切入點(diǎn)為癌癥的根治帶來了希望。基因治療是從分子層面入手，通過特殊傳遞系統(tǒng)將目的基因遞送至靶細(xì)胞，而目前基因治療的瓶頸則是尋求合適有效的基因載體系統(tǒng)。相較于免疫原性高、制備復(fù)雜的病毒

2、載體，非病毒載體由于其細(xì)胞毒性低、易于制備、無感染和惡化風(fēng)險等優(yōu)勢受到研究者的青睞，其中陽離子聚合物聚乙烯亞胺（polyethylenimine,PEI），由于其獨(dú)特的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”和良好的轉(zhuǎn)染效率，近年來研究較多。但PEI單獨(dú)使用時存在體液穩(wěn)定性差、高轉(zhuǎn)染效率與低細(xì)胞毒性不相兼得、無腫瘤特異靶向性等問題。由此，本課題組嘗試以細(xì)胞毒性低的支鏈型PEI2kDa為骨架，用天然高分子材料殼聚糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，構(gòu)建PEI衍生物，以期在降低細(xì)胞毒

3、性、增加生物相容性的同時確保高的轉(zhuǎn)染效率；再連接雙功能肽 tLyp-1—NLS（命名為 K12），增加聚合物腫瘤細(xì)胞靶向性，進(jìn)一步提高載體轉(zhuǎn)染效率。
　　本文第一章介紹了聚乙烯亞胺、殼聚糖單獨(dú)作為轉(zhuǎn)基因載體的應(yīng)用及缺陷，說明先對殼聚糖進(jìn)行改性再對聚乙烯亞胺進(jìn)行修飾的必要性；短肽 tLyp-1能與腫瘤新生血管及細(xì)胞膜上高表達(dá)的NRPs受體特異結(jié)合，NLS是核定位信號肽，可促進(jìn)細(xì)胞核遞送，進(jìn)一步靶向于細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)，依此提出設(shè)想，嘗試構(gòu)建

4、新型雙功能肽，再將其連接聚乙烯亞胺衍生物上，以期構(gòu)建轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低、有腫瘤細(xì)胞靶向性的新型轉(zhuǎn)基因載體。
　　第二章講述了本課題設(shè)想的新型轉(zhuǎn)基因載體的具體構(gòu)建方法：首先通過硼氫化鉀、N-甲基吡咯烷酮等對殼聚糖進(jìn)行改性，構(gòu)建季銨化殼聚糖OTMC S，再通過N-羥基琥珀酰亞胺將其連接到支鏈型PEI2kDa上，通過固相法合成雙功能肽K12，最后通過 SMCC法將前體 PEI衍生物與 K12連接，構(gòu)建載體OTMCS-PEI-K12，

5、并通過控制K12的投料比，構(gòu)建低、中、高功能肽比例的聚合物，分別命名為OTMCS-PEI-K12-2，OTMCS-PEI-K12-5，OTMCS-PEI-K12-10。通過質(zhì)譜、HPLC、1H-NMR對聚合物的合成情況進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)目的產(chǎn)物被成功合成，可用于后續(xù)實驗。
　　第三章通過體外實驗，考察不同K12投料比的OTMCS-PEI-K12的理化性質(zhì)：通過酸堿滴定實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過OTMCS和K12修飾的PEI，緩沖能力有所減弱，但相

6、較于生理鹽水，仍表現(xiàn)出良好的緩沖效果；通過瓊脂糖電泳實驗考察OTMCS-PEI-K12包合DNA能力，發(fā)現(xiàn)2、5、10倍K12投料比的OTMCS-PEI-K12分別能在w/w為0.8，1.2，1.6時將DNA完全縮合，且可以抵抗至少50U DNase I/μg DNA和200μg/mL的肝素鈉的解離；通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，聚合物OTMCS-PEI-K12單體呈現(xiàn)枝椏蓬松狀，結(jié)合 DNA后，復(fù)合物OTMCS-PEI-K12/DNA呈結(jié)構(gòu)緊密的

7、橢圓形，且納米粒子分散系均一、穩(wěn)定，通過粒度-電位儀檢測，發(fā)現(xiàn)在復(fù)合物質(zhì)量比為5—30之間時， OTMCS-PEI-K12/DNA粒徑約為100—600nm，Zeta電位約為1—36mV；通過MTT、水解實驗考察OTMCS-PEI-K12的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示，即使在高濃度下， OTMCS-PEI-K12仍表現(xiàn)出低的細(xì)胞毒性低，且能在60h后水解為小分子，有良好的生物降解性。
　　第四章通過體外細(xì)胞實驗，考察了OTMCS-PEI-K

8、12的轉(zhuǎn)染能力，并通過在細(xì)胞系中添加不同抑制劑，初步探究聚合物的胞內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制：選用 B16和 U87細(xì)胞系，以綠色熒光蛋白pEGFP-N2和蟲熒光素酶pGL3-Control為報告基因，選用PEI25kDa作為陽性對照，結(jié)果顯示，PEI2kDa轉(zhuǎn)染效率明顯低于PEI25kDa，但隨著OTMCS、K12的逐步修飾，聚合物轉(zhuǎn)染效率逐漸增強(qiáng)，在相同質(zhì)量比下，新合成的載體OTMCS-PEI-K12轉(zhuǎn)染效果好于PEI25kDa；OTMCS-PEI

9、-K12在不同細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染效果不同，其在U87中的轉(zhuǎn)染效果明顯優(yōu)于B16；不同K12投料比的OTMCS-PEI-K12在 U87中轉(zhuǎn)染效果有所差異，相同條件下， OTMCS-PEI-K12-5轉(zhuǎn)染效果最好。通過在細(xì)胞系中添加微管、微絲、Dynein抑制劑考察胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)情況發(fā)現(xiàn)：微管的動態(tài)平衡對OTMCS-PEI-K12影響不大，而當(dāng)胞內(nèi)微絲、Dynein受到抑制時，OTMCS-PEI-K12的轉(zhuǎn)染受到抑制，且隨抑制劑濃度增大，轉(zhuǎn)染效率降低

10、，說明OTMCS-PEI-K12是受體介導(dǎo)的特異性胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，適宜機(jī)體中非分裂分化細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。
　　第五章在前期研究基礎(chǔ)上，選擇體外轉(zhuǎn)染效果最好的OTMCS-PEI-K12-5作為載體，以ING4為治療基因，通過構(gòu)建U87無胸腺小鼠腫瘤模型，采用尾注、瘤注兩種給藥方式，考察不同質(zhì)量比載藥復(fù)合物OPK5/DNA的腫瘤組織靶向性及治療能力。結(jié)果表明，通過尾靜脈給藥且復(fù)合物OPK5/DNA在w/w=12時，目的基因誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫