呋喃妥因及其代謝物的殘留檢測分析研究.pdf

1、硝基呋喃類是人工合成的廣譜抗生素，因抗菌效果好、價格低廉等優(yōu)點，曾被普遍用于治療動物中的某些細菌性感染疾病和作為飼料添加劑促進動物生長。它們在動物體內(nèi)被迅速代謝，其主要代謝物在體內(nèi)存留時間較長。研究表明硝基呋喃類及其代謝物具有潛在的致畸性和致突變性，許多國家畜牧業(yè)領(lǐng)域已禁止此類藥物使用。但一些人在經(jīng)濟利益等驅(qū)使下，違法使用的現(xiàn)象仍有發(fā)生。為了控制獸藥的殘留，保障動物源性食品的安全，有必要建立一種快速、有效的分析方法對其殘留進行檢測。

2、r>　　呋喃妥因（NFT）常被作為飼料添加劑來促進動物的生長，在動物體內(nèi)代謝迅速，半衰期短，代謝物1-氨基乙內(nèi)酰脲（AHD）與組織蛋白結(jié)合牢固，在體內(nèi)存留時間長，因此，可以檢測動物組織中的AHD殘留來監(jiān)測原藥NFT的非法使用。本文以原藥NFT及其代謝物AHD為研究對象，分別利用高效液相色譜（HPLC）方法以及間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法（ELISA）檢測飼料中 NFT的殘留以及動物組織中AHD的殘留。主要研究結(jié)果如下：
　　①在傳統(tǒng)方

3、法的基礎(chǔ)上，選擇較簡單的流動相乙腈-水，建立HPLC方法檢測原藥NFT的殘留，并進行色譜條件優(yōu)化和方法學驗證。方法的檢測限和定量限分別為0.02μg/mL和0.1μg/mL，NFT在飼料中的檢測限和定量限分別為0.2mg/kg和0.7mg/kg。該結(jié)果低于農(nóng)業(yè)部1486號公告的標準（檢測限和定量限分別為0.3mg/kg和1.0mg/kg）。
　　②代謝物AHD與對羧基苯甲醛衍生制備半抗原1-(4-羧基苯亞甲基)-氨基乙內(nèi)酰脲（CP

4、AHD），經(jīng)質(zhì)譜、核磁和紅外表征表明其制備成功。然后通過活化酯法和混合酸酐法制備了免疫原CPAHD-BSA(Z)和CPAHD-BSA(L)。通過紫外掃描表征并計算半抗原與載體蛋白的結(jié)合比分別為12.5和4.4。同時，利用家兔作為免疫動物制備多克隆抗體，經(jīng)ELISA方法檢測表明：免疫原CPAHD-BSA(Z)產(chǎn)生的抗體具有良好的靈敏性和特異性，進一步說明免疫原CPAHD-BSA(Z)制備成功。免疫原CPAHD-BSA(L)未表示出良好的效

5、果，其可能原因在于偶聯(lián)物中半抗原與載體蛋白的結(jié)合比較低，不能夠刺激機體產(chǎn)生針對小分子的抗體。
　?、壑苽淇贵w的同時，對實驗家兔生長性能和器官指數(shù)進行了跟蹤測試，結(jié)果表明家兔的平均增重顯著提高（p<0.05），同時心臟指數(shù)和腎臟指數(shù)顯著提高（p<0.05），而對肝臟的影響不顯著（p>0.05）。由此可以看出，在制備抗體的過程中提高了家兔的生長性能以及心臟和腎臟指數(shù)，對肝臟無明顯影響。
　?、芾貌煌瑒┝康拿庖咴瑿PAHD-BS

6、A(Z)和CPAHD-BSA(L)免疫小鼠制備多克隆抗體，通過ELISA方法，分別以CPAHD-OVA（Z）和CPAHD-OVA（W）作為包被原進行檢測時，免疫原CPAHD-BSA(Z)產(chǎn)生的抗體具有較高的效價，其效價范圍為1：32000～1：256000。與免疫原CPAHD-BSA(Z)相比，免疫原CPAHD-BSA(L)未顯示出良好的效價。
　　⑤利用間接競爭ELISA方法檢測動物組織中AHD的殘留，首先對方法參數(shù)進行優(yōu)化，選

7、擇靈敏度最高的抗體（6014）通過優(yōu)化的方法進行檢測。該方法具有良好的精密度，其 IC50值為4.93ng/mL，在豬肉組織和雞肉組織中的檢測限分別為0.17和0.16μg/kg。同時，抗體對1-(2-硝基苯亞甲基)-氨基乙內(nèi)酰脲（NPAHD）具有良好的特異性，除了與半抗原CPAHD和原藥NFT具有一定的交叉反應(yīng)外，對其他競爭物幾乎無交叉反應(yīng)。在豬肉和雞肉組織中添加AHD后檢測，平均回收率范圍為85%-90%，變異系數(shù)小于10%。并用H