呋喃妥因及其代謝物的殘留檢測(cè)分析研究.pdf

1、硝基呋喃類是人工合成的廣譜抗生素，因抗菌效果好、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，曾被普遍用于治療動(dòng)物中的某些細(xì)菌性感染疾病和作為飼料添加劑促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。它們?cè)趧?dòng)物體內(nèi)被迅速代謝，其主要代謝物在體內(nèi)存留時(shí)間較長(zhǎng)。研究表明硝基呋喃類及其代謝物具有潛在的致畸性和致突變性，許多國(guó)家畜牧業(yè)領(lǐng)域已禁止此類藥物使用。但一些人在經(jīng)濟(jì)利益等驅(qū)使下，違法使用的現(xiàn)象仍有發(fā)生。為了控制獸藥的殘留，保障動(dòng)物源性食品的安全，有必要建立一種快速、有效的分析方法對(duì)其殘留進(jìn)行檢測(cè)。

2、r>　　呋喃妥因（NFT）常被作為飼料添加劑來(lái)促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，在動(dòng)物體內(nèi)代謝迅速，半衰期短，代謝物1-氨基乙內(nèi)酰脲（AHD）與組織蛋白結(jié)合牢固，在體內(nèi)存留時(shí)間長(zhǎng)，因此，可以檢測(cè)動(dòng)物組織中的AHD殘留來(lái)監(jiān)測(cè)原藥NFT的非法使用。本文以原藥NFT及其代謝物AHD為研究對(duì)象，分別利用高效液相色譜（HPLC）方法以及間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法（ELISA）檢測(cè)飼料中 NFT的殘留以及動(dòng)物組織中AHD的殘留。主要研究結(jié)果如下：
　?、僭趥鹘y(tǒng)方

3、法的基礎(chǔ)上，選擇較簡(jiǎn)單的流動(dòng)相乙腈-水，建立HPLC方法檢測(cè)原藥NFT的殘留，并進(jìn)行色譜條件優(yōu)化和方法學(xué)驗(yàn)證。方法的檢測(cè)限和定量限分別為0.02μg/mL和0.1μg/mL，NFT在飼料中的檢測(cè)限和定量限分別為0.2mg/kg和0.7mg/kg。該結(jié)果低于農(nóng)業(yè)部1486號(hào)公告的標(biāo)準(zhǔn)（檢測(cè)限和定量限分別為0.3mg/kg和1.0mg/kg）。
　?、诖x物AHD與對(duì)羧基苯甲醛衍生制備半抗原1-(4-羧基苯亞甲基)-氨基乙內(nèi)酰脲（CP

4、AHD），經(jīng)質(zhì)譜、核磁和紅外表征表明其制備成功。然后通過(guò)活化酯法和混合酸酐法制備了免疫原CPAHD-BSA(Z)和CPAHD-BSA(L)。通過(guò)紫外掃描表征并計(jì)算半抗原與載體蛋白的結(jié)合比分別為12.5和4.4。同時(shí)，利用家兔作為免疫動(dòng)物制備多克隆抗體，經(jīng)ELISA方法檢測(cè)表明：免疫原CPAHD-BSA(Z)產(chǎn)生的抗體具有良好的靈敏性和特異性，進(jìn)一步說(shuō)明免疫原CPAHD-BSA(Z)制備成功。免疫原CPAHD-BSA(L)未表示出良好的效

5、果，其可能原因在于偶聯(lián)物中半抗原與載體蛋白的結(jié)合比較低，不能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)小分子的抗體。
　　③制備抗體的同時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)家兔生長(zhǎng)性能和器官指數(shù)進(jìn)行了跟蹤測(cè)試，結(jié)果表明家兔的平均增重顯著提高（p<0.05），同時(shí)心臟指數(shù)和腎臟指數(shù)顯著提高（p<0.05），而對(duì)肝臟的影響不顯著（p>0.05）。由此可以看出，在制備抗體的過(guò)程中提高了家兔的生長(zhǎng)性能以及心臟和腎臟指數(shù)，對(duì)肝臟無(wú)明顯影響。
　　④利用不同劑量的免疫原CPAHD-BS

6、A(Z)和CPAHD-BSA(L)免疫小鼠制備多克隆抗體，通過(guò)ELISA方法，分別以CPAHD-OVA（Z）和CPAHD-OVA（W）作為包被原進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，免疫原CPAHD-BSA(Z)產(chǎn)生的抗體具有較高的效價(jià)，其效價(jià)范圍為1：32000～1：256000。與免疫原CPAHD-BSA(Z)相比，免疫原CPAHD-BSA(L)未顯示出良好的效價(jià)。
　?、堇瞄g接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)動(dòng)物組織中AHD的殘留，首先對(duì)方法參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選

7、擇靈敏度最高的抗體（6014）通過(guò)優(yōu)化的方法進(jìn)行檢測(cè)。該方法具有良好的精密度，其 IC50值為4.93ng/mL，在豬肉組織和雞肉組織中的檢測(cè)限分別為0.17和0.16μg/kg。同時(shí)，抗體對(duì)1-(2-硝基苯亞甲基)-氨基乙內(nèi)酰脲（NPAHD）具有良好的特異性，除了與半抗原CPAHD和原藥NFT具有一定的交叉反應(yīng)外，對(duì)其他競(jìng)爭(zhēng)物幾乎無(wú)交叉反應(yīng)。在豬肉和雞肉組織中添加AHD后檢測(cè)，平均回收率范圍為85%-90%，變異系數(shù)小于10%。并用H