青霉菌penicilliumsp.聚半乳糖醛酸酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究

1、基因在畢赤酵母中的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究C l o n i n g ．p r e s s i o na n d U l o n i n ge x p r e s s l o n a n d C h 。a r a c t ‘e r t ‘z a t i ‘o no r —a ，p o l y g a l a c t u r o n a s e i nP i c h i a p a s t o r i sf r o m t h eP e n i

2、 c i l l i u m s p ．學(xué)位申請人：指導(dǎo)教師：學(xué)科專業(yè)：學(xué)位類別：授予單位：答辯日期：曹威張偉教授張偉副研究員發(fā)酵工程工學(xué)碩士河北農(nóng)業(yè)大學(xué)二O 一一年五月二十九日摘要果膠酶是一類分解果膠的酶的總稱。聚半乳糖醛酸酶是果膠酶的一種，屬于果膠水解酶類，屬于糖苷水解酶2 8 家族( G H 2 8 ) 。聚半乳糖醛酸酶作為果膠酶家族中的主要成員，它能夠以隨機(jī)方式水解果膠光滑區(qū)的n ( 1 _ 4 ) 糖苷鍵，迅速降低果膠粘度，在

3、食品、紡織、醫(yī)藥、造紙、環(huán)境、生物技術(shù)和飼料等方面應(yīng)用廣泛，聚半乳糖醛酸酶的研究具有重要的理論意義和實用價值。本研究從來源于腐敗柑橘的樣品中篩選到一株產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶的菌株F J 2 ，通過菌落觀察和1 8Sr D N A 分子鑒定，鑒定該菌株屬于青霉菌屬( P e n i c i l l i u m s p ．) 。通過對聚半乳糖醛酸酶蛋白序列的多序列比對，找到了保守基序并設(shè)計簡并引物，以P e n i c i l l i u ms

4、p ．F J 2 的基因組D N A 為模板，簡并引物P C R 擴(kuò)增得到保守區(qū)核酸序列。進(jìn)一步使用熱不對稱交錯P C R ( T A I L - P C R ) 擴(kuò)增得到側(cè)翼未知序列，進(jìn)而得到一個聚半乳糖醛酸酶基因的全長序列。使用G E N S C A N 和N C B I B l a s t x 分析基因中內(nèi)含子的位置和數(shù)量，然后利用重疊P C R 得到基因的c D N A 序列。該基因全長1 2 2 5b p ，包含2 個內(nèi)含子，

5、其e D N A 全長1 1 0 4 b p ，編碼3 6 7 個氨基酸和一個終止密碼子，前1 8 個氨基酸為信號肽序列，有三個潛在的糖基化位點：2 9 8 N G S ，3 1 8N v T 和3 3 6N G S 。將無信號肽編碼序列的基因e D N A 命名為p g p l 。p g p l 基因連接表達(dá)載體p E T 3 0 a ( + ) 轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)I P T G 誘導(dǎo)表達(dá)后為包涵體形式。p g p l 基因連接表達(dá)載體

6、p P I C 9 ，在巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功進(jìn)行了異源分泌表達(dá)。在3L 發(fā)酵罐水平，培養(yǎng)基上清中聚半乳糖醛酸酶活力達(dá)到7 0 0 U ／m L 。經(jīng)糖苷水解酶H 水解糖苷鏈分析，畢赤酵母表達(dá)的P G P l 有部分糖基化現(xiàn)象。酶學(xué)性質(zhì)測定表明，重組酶蛋白P G P l 的最適p H 為5 ．0 ，在p H 4 ．0 ～6 ．0 下處理1h 后，剩余酶活力超過9 0 ％；最適溫度為3 8 ℃；以聚半乳糖醛酸為底物，測得P G P

7、l 的K m - - - 1 ．1 7 2 ±0 ．1 6 9m 咖L 聚半乳糖醛酸，‰戤= 0 ．0 6 1 ±0 ．0 0 2m 咖i n ／m L 。P G P l 的酶活力不受N a + 、K _ 和E D T A 的影響。而S D S 和C T A B 會強(qiáng)烈的抑制酶的活力，相反T r i t o n 會增強(qiáng)酶的活力。在含1 0m m o l ／LM g + 的條件下會使酶活力喪失約5 0 ％，而1 0 m