柑橘綠霉菌多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆和功能分析.pdf

1、果膠酶是植物病原物突破植物細(xì)胞壁的主要細(xì)胞壁降解酶之一。真菌多聚半乳糖醛酸酶（endopolygalacturonase，PG）作為主要的果膠酶成員，可以降解植物細(xì)胞壁的主要成分同源半乳糖聚糖，在一些真菌和植物互作系統(tǒng)中被證明是真菌的致病因子，決定病菌的致病性，但在另一些互作系統(tǒng)中，單個(gè)多聚半乳糖醛酸酶基因的敲除并沒有導(dǎo)致病菌致病力的下降。柑橘綠霉?。≒enicillum digitatum Sacc.）的互作體系不同于已研究的真菌一植

2、物互作體系，即病菌只能從傷口侵入，只能為害成熟的柑橘果實(shí)，寄主不是植物體，是果皮富含果膠并逐漸衰老的離體果實(shí)。雖然沒有實(shí)驗(yàn)證據(jù)，但從病害軟腐癥狀判斷，水解酶應(yīng)該參與致病過程。
　　 為證實(shí)在柑橘綠霉菌一柑橘這個(gè)特殊互作系統(tǒng)中柑橘綠霉菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶是否參與致病過程，本研究根據(jù)已報(bào)道的柑橘綠霉菌多聚半乳糖醛酸酶基因（Pdpgl）序列設(shè)計(jì)合成特異性引物，從基因組DNA中擴(kuò)增獲得Pdpgl的全長(zhǎng)基因。氨基酸序列分析表明：Pdp

3、gl與其他真菌如Penicillum olsonii的pgl（79％）和Penicillumgriseoroseum的pgl（85％）等具有較高的同源性，其開放閱讀框?yàn)?101bp，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，編碼蛋白的N端有一段長(zhǎng)為18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列。表達(dá)分析表明Pdpgl是一個(gè)組成型基因，其表達(dá)不受葡萄糖的抑制。Real-time PCR分析結(jié)果表明，Pdpgl是一個(gè)酸性表達(dá)基因，pH4.0時(shí)表達(dá)水平最高，大約是pH7.0的1

4、5倍。
　　 論文構(gòu)建了Pdpgl基因敲除載體△Pdpgl和過表達(dá)載體EX-vector，應(yīng)用根癌土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化（ATMT）方法轉(zhuǎn)化柑橘綠霉菌菌株P(guān)dw03，獲得的轉(zhuǎn)化子△Pdpgl-10，△Pdpgl-38，EX-3，Etc-2經(jīng)PCR和Southern bloting驗(yàn)證，確定為Pdpgl基因敲除、過表達(dá)及異位插入突變體。實(shí)驗(yàn)表明，在常規(guī)的PDA培養(yǎng)基上，Pdpgl基因敲除和過表達(dá)突變體與野生型親本菌株P(guān)dw03在

5、菌落特征/菌絲生長(zhǎng)速率和分生孢子產(chǎn)生上沒有顯著的不同。但在果膠（誘導(dǎo)）培養(yǎng)基上培養(yǎng)15天，野生型和各突變體均未產(chǎn)孢，敲除突變體的生長(zhǎng)速度明顯慢于野生型菌株，而過表達(dá)及異位插入突變體的生長(zhǎng)速度與野生型沒有顯著性差異。Pdpgl基因敲除突變體的果膠酶活性比野生型降低了26％，過表達(dá)突變體的酶活性比野生型提高了26％，插入突變體與野生型非常接近，沒有差異。Pdpgl基因敲除和過表達(dá)突變體，以及野生型菌株分別刺傷接種柑橘果實(shí)，結(jié)果顯示：敲除突變