原果膠酶在畢赤酵母中的表達(dá)、發(fā)酵優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、原果膠酶是能水解不溶性果膠物質(zhì)為可溶性果膠物質(zhì)的一類酶。1978年Sakai等首次報(bào)道了酵母生產(chǎn)的原果膠酶，之后相繼報(bào)道了細(xì)菌、酵母和霉菌中的原果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)及原果膠酶的應(yīng)用。在中國(guó)，有關(guān)微生物原果膠酶的研究和應(yīng)用技術(shù)還未見(jiàn)報(bào)道，原果膠酶基因在Pichiapastoris中表達(dá)的研究在國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本論文主要報(bào)道了產(chǎn)原果膠酶B.subtilisXZ2的篩選、原果膠酶基因在Pichiapastoris中克隆表達(dá)、重組原果膠酶的純化和酶

2、學(xué)性質(zhì)等研究?jī)?nèi)容，研究的主要結(jié)果如下：1.通過(guò)對(duì)本研究室保藏的菌種進(jìn)行篩選，獲得了一株產(chǎn)原果膠酶的B.subtilisXZ2。以B.subtilisXZ2的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到原果膠酶基因。測(cè)序結(jié)果表明：B.subtilis原果膠酶基因全長(zhǎng)1200bp，編碼399個(gè)氨基酸，與GenBank中收錄的B.subtilis的原果膠酶基因(GenBankAccession：X74880)相比較，有4個(gè)堿基發(fā)生了替換，其同源性為99

3、.6％，編碼的氨基酸序列同源性為99.5％，二者原果膠酶蛋白基因相應(yīng)的氨基酸序列、氨基酸殘基個(gè)數(shù)、位置幾乎完全相同，僅有2個(gè)氨基酸不同。同時(shí)，替換的氨基酸不位于原果膠酶的兩個(gè)保守區(qū)域。 2.擴(kuò)增的原果膠酶基因與畢赤酵母載體pPICZαA經(jīng)限制性內(nèi)切酶XhoI和XbaI雙酶切，回收片段經(jīng)T4DNAligase、16℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物經(jīng)CaCl2轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，獲得重組酵母表達(dá)載體pPICZαA-PPase。經(jīng)限制性內(nèi)切

4、酶BstXI線性化的pPICZαA-PPase載體與酵母感受態(tài)細(xì)胞X-33在1500V，25μF，200Ω條件下電轉(zhuǎn)化，經(jīng)過(guò)100、200、400、800μg和1000μg/mlzeocin篩選和酵母基因組PCR鑒定，最終獲得重組表達(dá)菌株X-33/pPICZαA-PPase。 3.對(duì)影響X-33/pPICZαA-PPase表達(dá)原果膠酶的培養(yǎng)基、誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇濃度、誘導(dǎo)前菌體生長(zhǎng)量、誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH以及PTM1添加量等因素進(jìn)行了研究

5、，結(jié)果顯示在使用BMGY/mBMMY培養(yǎng)基、誘導(dǎo)環(huán)境pH6.0、0.006％PTM1、誘導(dǎo)前最佳菌體0D600為6-8、1％甲醇誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)速240r/min，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)96h，可以獲得較好的表達(dá)水平；高密度發(fā)酵階段，控制溶氧20％，氨水流加控制培養(yǎng)基pH6.0，經(jīng)過(guò)210h發(fā)酵培養(yǎng)菌體光密度超過(guò)了250，濕菌體達(dá)到了192g/L，蛋白含量為3.21g/L，原果膠酶活性達(dá)到最高240.2U/ml。 4.搖瓶發(fā)酵獲得的原果膠酶粗酶液

6、經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀、SephadexG75凝膠過(guò)濾和SepharoseFastFlow離子交換層析分離，比活力分別提高為219.27U/mg、752.48U/mg、1948.64U/mg，純化倍數(shù)分別為2.13、7.31和18.91，最終獲得的原果膠酶經(jīng)SDS-PAGE電泳測(cè)定分子量為43.17kDa。 5.原果膠酶最適作用溫度和pH分別50℃和7.0。在pH3-10范圍內(nèi)，原果膠酶活性很穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性為50℃以下。金屬離子對(duì)于原果膠