冬棗(ziziphusjujubamill.)果實(shí)多聚半乳糖醛酸酶多克隆抗體制備及抑制劑篩選

1、河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文冬棗（Ziziphus jujuba Mill.）果實(shí)多聚半乳糖醛酸酶多克隆抗體制備及抑制劑篩選姓名：郭函子申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：果樹學(xué)指導(dǎo)教師：溫陟良;彭士琪2001.6.1摘 要多聚半乳糖醛酸酶( P o l y g a l a c t u r o n a s e ．E ．c ．3 ．2 ．1 ．1 5 ．簡稱P G ) 是一種催化果膠物質(zhì)降解的細(xì)胞壁水解酶，它廣泛存在于二植物體的各個(gè)部分，具有促進(jìn)器官脫落

2、、花藥開裂、花粉管伸長以及果實(shí)軟化的作用。有研究表明，在棗果實(shí)成熟軟化過程中，P G 起著主導(dǎo)作用。為了研究P G 在這一過程中的內(nèi)在機(jī)制、實(shí)現(xiàn)利_ I } J 基因．1 程的手段控制果實(shí)軟化，本試驗(yàn)以鮮食棗品種冬棗為材料，對(duì)P G 進(jìn)行了純化、抗體制各以及部分性質(zhì)測定。∞冬棗粗酶液用P E G 一2 0 0 0 0 濃縮，經(jīng)C M - s e p h a r o s eC L6 B 陽離子交換柱( 1 ．6 e m ×4 0

3、 c m ) 層析分離，川乙酸鈉4 0 m M 一2 0 0 m M 進(jìn)行梯度洗脫，收集活性組分，將活性部分用P E G 一2 0 0 0 0 濃縮，再過S e p h a d e xG 一7 5 ( L 0 c m×8 0 c m ) 凝膠牲過濾，用4 0 m M 的乙酸鈉緩沖液和1 m M 的D T T 洗脫，收集活性組分，將活性部分用P E G 一2 0 0 0 0 濃縮，得到了純化5 0 倍的P G 酶蛋向，經(jīng)S D

4、S ．P A G E 得到一條蛋白譜帶。以純化的P G 酶蛋白為抗原，免疫日本大耳白大白兔，得到棗P G 蛋白的多克隆抗體，再經(jīng)飽和硫酸銨沉淀得到純化的抗血清，W e s t e r nb l o t i n g 分析能與P G 發(fā)生特異性結(jié)合J 通過對(duì)各種抑制劑對(duì)酶活性影響的研究發(fā)現(xiàn)，二價(jià)金屬離子C a ”、M g ”、Z n ”、H 9 2 + 均能部分抑制酶活性，M n 2 + 和C u 2 + 能強(qiáng)烈促進(jìn)酶活性，E D T A

5、可以促進(jìn)酶活性，三價(jià)金屬離子F e ”對(duì)酶活性促進(jìn)作用較強(qiáng)，而A P 卻可以強(qiáng)烈的抑制酶活性，N a + 和K + 在低濃度時(shí)對(duì)酶都有促進(jìn)的作用，但在高濃度時(shí)有抑制作用；陰離子表面活性劑S D S 和非離子型表面活性劑T r i t o nx ．1 0 0 對(duì)酶活性有促進(jìn)作j } j ，在1 ％濃度時(shí)相對(duì)酶活性分別是1 5 0 ％} n 1 4 4 ％：陽離子表面活性劑C T A B 抑制作用較強(qiáng)，在濃度0 ．1 ％時(shí)相對(duì)活性為7 0

6、％；巰基試劑2 - M E對(duì)酶活性具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用；植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)2 ，4 - D 和I A A 均能夠抑制酶活性，而N A A 和乙烯促進(jìn)酶活性，G A ，對(duì)酶活性無影響。經(jīng)S D S —P A G E測得棗P G 蛋白的分子量是3 1 5 0 0 ，比其它果實(shí)中的P G 蛋白的分子量?。籔 G蛋白的p H 穩(wěn)定范圍是4 ．5 —8 ．0 ；最適離子強(qiáng)度范圍是0 ．0 4 m o l ／L 0 ．0 6m o l ／L ；P G